オリゴデンドロサイト前駆体に胚性幹細胞の分化

Summary

我々は、小分子ベースのオリゴデンドロサイト前駆細胞体（OPC）にマウス胚性幹細胞の分化のためのプロトコルについて説明します。このプロトコルは、分化の30日間で高効率とOlig2 + NG2 + OPCを生成します。我々はまた、活動電位を発生させることができる"スパイク"OPCを生成する方法を説明します。

Abstract

オリゴデンドロサイトは、中枢神経系のmyelinating細胞である。脱髄疾患における再生細胞療法の場合は、移植のための系統にコミットされたオリゴデンドロサイト前駆細胞体（OPC）の純粋な集団を導出に大きな関心が寄せられている。 OPCは、転写因子Olig2とプロテオグリカンNG2の表面発現の活動によって特徴付けられる。 GFP – Olig2（G – Olig2）マウス胚性幹細胞（MESC）レポーターのラインを使用して、我々はGFP + Olig2 + NG2 + OPCはにmESCsの分化のための条件を最適化。我々のプロトコルでは、まずmESCsから胚様体の世代（EBS）を説明します。オリゴデンドログリア系譜に直接EBの分化に定義された培養条件下で（1）レチノイン酸（RA）及び（2）ソニックヘッジホッグ（Shh）アゴニストpurmorphamine（ピュール）：第二に、我々は、小分子とMESC由来のEBの治療について説明します。このアプローチによって、OPCは、30日の期間に高効率（> 80％）で得ることができます。このプロトコルでmESCsに由来する細胞は、一次組織培養から派生したOPCのに表現型が類似しています。 MESC由来のOPCはその場で脳のOPCのサブポピュレーションのために説明するスパイクプロパティが表示されません。この電気生理学的性質を調べるために、我々は、異所的にNaの発現させることにより、MESC由来のOPCをスパイクの発生を説明_V 1.2サブユニット。このプロトコルから得られたスパイクとnonspiking細胞は、OPCの二つ亜集団での機能研究を進めるのに役立ちます。

Protocol

GFP – Olig2マウス胚性幹細胞（mESCs）からオリゴデンドロサイト前駆細胞（OPCを）生成の詳細な手順： マウスES細胞株GFP – Olig2（G – Olig2）は、アメリカンタイプカルチャーコレクション（ATCC）から購入しています。 mESCsは、日常的に照射したマウス胚性線維芽細胞（MEF）フィーダー層の上に3日毎に継代されています。 MEF細胞はES細胞を継代する前に少なくとも一日0.1％ゼラチンコートした6ウェル組織培養プレートに播種されています。 MESC培地は、20％ウシ胎児血清（GIBCO）、2mM L -グルタミン、1mMピルビン酸ナトリウム、0.1mMのβ-メルカプトエタノール/、1％非必須アミノ酸（を添加したダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）（GIBCO）です。 NEAA）、および1,000 U / mlの白血病抑制因子。 MESのコロニーは単一の細胞に（TrypLE、5分、37 ° C）をトリプシン処理し、ノックアウト血清代替（KSR）培地に懸濁されて、その後、細胞は細胞でコスター超低アタッチメント6ウェルプレート（コーニング）に転送されます。 50,000細胞/ cm 2の密度。これらの条件では、mESCsは胚様体（EB）を形成する。 KSRの培地は、20％KSR、1mMピルビン酸ナトリウム、1％NEAA、および0.1mMβ-メルカプトエタノール/を補充必須培地（- MEM） – 最小限で構成されています。 4日から7日目に、レチノイン酸（RA、0.2 M）とpurmorphamine（ピュール、1 M）は、図2に示すように含まれています。 KSRまたはN2培地中の1A。 N2の媒体は1X N2サプリメント、1mMピルビン酸ナトリウム、1％NEAA、および0.1mMβ-メルカプトエタノール/を含む- MEMです。培地は毎日変更されます。 8日目で、EBはN2培地および線維芽細胞増殖因子-2（FGF – 2、20 ng / ml）のから構成されるOPCの培地中0.01％ポリオルニチンコートしたディッシュ上TrypLE（5分、37℃）およびメッキを使用して細分化されています。培地は2日毎に変更されます。 細胞はトリプシン処理（TrypLE、3分、37 ° C）と彼らがコンフルエントになるとほぼ毎週色を保ち続けるされています。 30日目では、細胞の80％以上がGFP/Olig2表現を見せると、NG2陽性OPCの特徴です。 スパイクOPCを生成するには、BacMamのNa +チャネルのキットは、これらのMESC由来のOPCはにのNa V 1.2サブユニットを導入するために使用されます。 BacMam試薬（1 mlの成分）5 mlの最終量になるようにPBSと混合される。その後、混合BacMam試薬はPBSで洗浄する前に60 mmの培養皿（50〜70％の合流点）でMESC由来のOPCは文化に追加されます。 2時間のインキュベーションの後、混合BacMam試薬は1Xエンハンサーを添加したOPCの培地を除去し置き換えられます。エンハンサーは、BはDMSO（成分C）中で再構成するコンポーネントです。次に、追加の2時間のインキュベーションの後にエンハンサーを持つ媒体は完全なOPCの培地を除去し置き換えられます。細胞を24時間後にアッセイされる。 代表的な結果： 図に示すように差別化プロトコルに従って。 1A、G – Olig2のmESCsは、最初に胚様体（EB）（図1B）を形成するためにKSR培地で4日間懸濁した。その後、私たちは順番にRAとピュールでEBSを処理した。 EBは、4日目で、任意のGFPの蛍光を示し、D8（図1B）で強いGFPの蛍光を発現していない。この時点で、EBは成長因子FGF – 2を添加したN2培地でトリプシン処理し、播種した。 22日（D30）さらに培養後、GFP +細胞の割合は80.3に達し、± 0.6％を私たちのフローサイトメトリーの結果によると。図に示す。 1C、GFP +細胞は一貫してNG2染色（96.4 ± GFP陽性細胞の1.3％プラスのNG2、および94.8 ± NG2陽性細胞の1.5％がGFP陽性であった）と重なる。従って、これらの細胞は、OPCとして定義する、GFP/Olig2とNG2を表現。 MESC由来のOPCは（76セル）脱分極（図2A）により活動電位を発生させることに失敗しました。のNa V 1.2サブユニットを運ぶバキュロウイルスで形質導入した後、これらのMESC由来のOPCは（17細胞の94.1％、16）（図2B）スパイクに分類される。 図1。 OPCはにGOlig – MESCの分化。胚様体（EB）をベースと小分子駆動型分化のプロトコルを示す（）スキーム。 D8で、EBは、細分化し、メッキだった。彼らがコンフルエントになった時点で細胞は1週間に1回継代した。 （B）D8ではなく、D4 EBは、GFPの発現を示した。 （C）NG2（赤）の免疫染色では、D30でのGFP（緑色）の発現と一致していた。 DAPI（青）は核を識別するために使用されました。スケールバー：20 mmです。 図2。でMESC由来のOPCをnonspikingからスパイクOPCの世代のウイルス媒介セルが0に脱分極した場合でも、 ナトリウムVチャネルの発現。（A）膜電位が-60 mVとMESC由来のOPCが開催されましたが、活動電位を発生させることに失敗しましたmVの。 （B）MESC由来のOPCの例ウイルスの導入後の活動電位を（赤で強調表示）焼成。

Discussion

胚盤胞の胚から単離した胚性幹細胞（ESC）は、オリゴデンドロサイトの仕様を含め、初期の哺乳類の発達を研究するためのin vitroのモデル系の提供、生物^3、4のすべての細胞系譜に分化することができる。 mESCsは、ソニックヘッジホッグ^（Shh）5の治療法とオリゴデンドロサイト前駆細胞体（OPC）に分化することが示されている。また、mESCsからShhの誘発性OPCの分化は、胚発生⁶で観察された正しいタイミングを維持します。したがって、mESCsからin vitroでのOPC 分化の性質は、in vivoでの開発でから学んだされているものと一致するように考えられている。ここでは、小分子RAとShhのアゴニストピュールを使用して、我々は成功し、高効率でGFP + Olig2 + NG2 + OPCはにG – Olig2 mESCsを分化した。

プロテオグリカンNG2 ⁷とヘリックス-ループ-ヘリックス転写因子Olig2 ⁸の発現によって特徴付けOPCは、、彼らは全細胞のかなりの割合（〜5％）を構成している発展と成熟した中枢神経系におけるオリゴデンドロサイトを、生成する主な増殖細胞のタイプ^9。研究者は_{Vチャネル} Naは実証しているほぼ二十年のためのOPCの亜集団に発現し、脱分極^10,11によって起動することができます。また、最近の印象的な観察^​​9は その場ラットの中枢神経系の白質、OPCは（〜50％）生成された活動電位の電位依存性ナトリウム（Na _V）チャネルの発現に応じ時に脱分極することであり、したがって、スパイクに細分することができますと亜集団をnonspiking。しかし、これらのスパイクの特性の関数はまだほとんど知られていない。我々は、電気生理学的に、Shhの依存プロトコルで差別化MESC由来のOPCは、 その場脳のOPCの場合と同じではないことがわかった。サブユニットのNa _V 1.2を導入した後、これらのサイレントMESC由来のOPCはスパイクのことができた。

従って、MESC由来のOPCは、ここで説明分化プロトコルが容易に可能スパイク/ nonspiking（1）OPCをスパイクとnonspikingの機能の違いを勉強し、（2）スクリーニングMESC由来のOPCのでナトリウムチャネルの発現を促進することができる新しい要因、（ 3）開発と人間のESCまたは誘導多能性幹細胞（性IPSC）からOPCの分化のプロトコルを最適化。

Materials

Material Name	Tipo	Company	Catalogue Number	Comment
MEFs		GlobalStem	GSC-6001G
TrypLE Express		Invitrogen	12604
Retinoic acid		Sigma	R-2625
Purmorphamine		Cayman Chemical	10009634
FGF-2		Millipore	GF003
BacMam NaV 1.2		Invitrogen	B10341