Мы описываем небольшую молекулу-протокол для дифференциации мышиных эмбриональных стволовых клеток в клетки-предшественники олигодендроцитов (OPC). Этот протокол генерирует Olig2 + + NG2 OPCs с высоким КПД на 30 дней дифференциации. Мы также опишем метод для создания "пики" OPCs, что позволяет вести огонь потенциалов действия.
Олигодендроциты являются myelinating клетки центральной нервной системы. Для регенеративной клеточной терапии при демиелинизирующих заболеваний, существует значительный интерес в получении чистой популяции родословной только зафиксированных олигодендроцитов клеток-предшественников (OPC) для трансплантации. OPCs характеризуются деятельности Olig2 фактора транскрипции и поверхностных выражение NG2 протеогликанов. Использование GFP-Olig2 (G-Olig2) мышиных эмбриональных стволовых клеток (мЭСК) репортер линии, мы оптимизировали условия для дифференциации mESCs в GFP + Olig2 + + NG2 OPCs. В нашем протокола, мы сначала опишем поколения эмбриоидные тела (ЭТ) от mESCs. Во-вторых, мы описываем лечение мЭСК полученных ЭТ с малыми молекулами: (1) ретиноевой кислотой (RA) и (2) Еж Соник (SHH) агонист purmorphamine (PUR) при определенных условиях культура направить EB дифференциации на олигодендроглиальных линии. При таком подходе, OPCs может быть получен с высокой эффективностью (> 80%) в срок до 30 дней. Клетки, полученные из mESCs в этом протоколе фенотипически похож на OPCs основе первичной культуре ткани. МЭСК полученных OPCs не показывают пики имущество описано для субпопуляции мозга OPCs на месте. Для изучения этого электрофизиологических свойств, мы описываем поколения пики мЭСК полученных OPCs по эктопически выражения Na<sub> V</sub> 1,2 субъединицы. Пики и nonspiking клетки, полученные из этого протокола будет способствовать продвижению функциональные исследования на две субпопуляции OPCs.
Эмбриональные стволовые клетки (ЭСК), выделенных из бластоцисты эмбрион, могут дифференцироваться во все ячейки линий организма 3, 4, обеспечивая в модели системы пробирке для изучения раннего развития млекопитающих, в том числе олигодендроцитов спецификации. mESCs были показаны дифференцироваться в клетки-предшественники олигодендроцитов (OPC) с лечением Еж Соник (SHH) 5. Более того, Тсс-индуцированной OPC дифференциации от mESCs сохраняет правильную времени наблюдается в эмбриональном развитии 6. Таким образом, природа в пробирке OPC дифференциации от mESCs считается соответствует тому, что был изучен из в естественных условиях развития. Здесь, используя малые молекулы РА и Тсс Пур агонист, мы успешно дифференцированных G-Olig2 mESCs в GFP + Olig2 + + NG2 OPCs с высокой эффективностью.
OPCs, характеризуется выражением протеогликанов NG2 7 и спираль-петля-спираль транскрипционный фактор Olig2 8, генерировать олигодендроцитов в развивающихся и зрелых ЦНС, где они составляют значительный процент (~ 5%) от общего объема клеток и Основной пролиферирующих клеток типа 9. В течение почти двух десятилетий исследователи продемонстрировали Na V каналов выражаются в субпопуляции OPCs и может быть активирована на 10 деполяризации, 11. Более того, последние поразительное наблюдение 9 было то, что на месте ЦНС крыс белого вещества, OPCs (~ 50%), порожденный потенциалов действия, когда деполяризованной в зависимости от выражения напряжения натриевых (Na V) каналы, и поэтому могут быть подразделены на пики и nonspiking субпопуляций. Однако функции этих пики свойства до сих пор в значительной степени неизвестно. Мы обнаружили, что, электрофизиологическим, мЭСК полученных OPCs дифференцированы с Тсс-зависимых протокола, не были таким же, как на месте OPCs мозга. После введения субъединицы Na V 1.2, эти молчаливые мЭСК полученных OPCs способны были пики.
Таким образом, пики / nonspiking мЭСК полученных OPCs и дифференциации протокол, описанный здесь, может способствовать (1) изучение функциональных различий между пики и nonspiking OPCs, (2) скрининга новых факторов, которые могут способствовать выражению натриевых каналов в мЭСК полученных OPCs, ( 3) разработки и оптимизации дифференциации протокол OPCs из человеческих ЭСК или индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (iPSCs).
The authors have nothing to disclose.
Эта работа была частично поддержана грантами для WD из Национального института здоровья (RO1 NS059043 и RO1 ES015988), Национального общества рассеянного склероза, Roche Фонд Анемия исследований, Фельдштейн Медицинский фонд, и Shriners больницы для детей.
Мы хотели бы поблагодарить д-ра Дэвида Удовольствие и Дженнифер Plane для предложений. Мы заявляем, не конкурирующие интересы, связанные с этой статьей.
Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
---|---|---|---|---|
MEFs | GlobalStem | GSC-6001G | ||
TrypLE Express | Invitrogen | 12604 | ||
Retinoic acid | Sigma | R-2625 | ||
Purmorphamine | Cayman Chemical | 10009634 | ||
FGF-2 | Millipore | GF003 | ||
BacMam NaV 1.2 | Invitrogen | B10341 |