Vi beskriver en liten molekyl-baserat protokoll för differentiering av mus-embryonala stamceller till oligodendrocyte föregångare celler (OPC). Detta protokoll genererar Olig2 + NG2 + OPCs med hög effektivitet med 30 dagar av differentiering. Vi beskriver också en metod att generera "tillsatta" OPCs som kan avfyra aktionspotentialer.
Oligodendrocyter är myelinating celler i centrala nervsystemet. För regenerativ cellterapi i demyeliniserande sjukdomar, det finns stort intresse följer en ren population av släkt-engagerade oligodendrocyte föregångare celler (OPC) för transplantation. OPCs kännetecknas av verksamheten i transkriptionsfaktor Olig2 och yta uttryck för en proteoglycan NG2. Med hjälp av GFP-Olig2 (G-Olig2) musen embryonala stamceller (Mesc) reporter linje, optimerad vi förutsättningar för differentiering av mESCs i GFP + Olig2 + NG2 + OPCs. I vårt protokoll, beskriver vi först generationen av embryoid organ (EBS) från mESCs. För det andra beskriver vi behandling av Mesc-derived EBS med små molekyler: (1) retinoinsyra (RA) och (2) en Sonic Hedgehog (Shh) agonist purmorphamine (PUR) under definierade kulturen förutsättningar att direkt EB differentiering i oligodendroglial härstamning. Genom detta tillvägagångssätt kan OPCs erhållas med hög verkningsgrad (> 80%) i en tidsperiod på 30 dagar. Celler från mESCs i detta protokoll är fenotypiskt liknar OPCs härrör från primär vävnadskultur. Den Mesc-derived OPCs visar inte tillsatta egenskapen beskrivits för en subpopulation av hjärnan OPCs på plats. Att studera detta elektrofysiologiska egenskapen beskriver vi generering av tillsatta Mesc-derived OPCs av ectopically uttrycka Na<sub> V</sub> 1,2 subenhet. Den tillsatta och nonspiking celler från detta protokoll kommer att bidra till att förbättra funktionella studier av två subpopulationer av OPC.
Embryonala stamceller (ESC), isolerade från en blastocyst embryo, kan differentiera till alla cell linjer av organismen 3, 4, vilket ger en in vitro modellsystem för att studera tidiga däggdjurens utveckling, inklusive oligodendrocyte specifikation. mESCs har visat att differentieras till oligodendrocyte föregångare celler (OPC) med behandling av Sonic Hedgehog (Shh) 5. Dessutom behåller Shh-inducerade OPC differentiering från mESCs rätt timing observerats i embryonalutvecklingen 6. Därför är den typ av in vitro OPC differentiering från mESCs anses vara förenliga med vad som har lärt sig av in vivo utveckling. Här, med hjälp av små molekyler RA och Shh Pur agonist, differentierade vi framgångsrikt G-Olig2 mESCs i GFP + Olig2 + NG2 + OPCs med hög verkningsgrad.
OPC, som karakteriseras av uttryck för proteoglycan NG2 7 och helix-loop-helix transkriptionsfaktor Olig2 8, genererar oligodendrocyter i utvecklingsländerna och mogna CNS, där de utgör en betydande andel (~ 5%) av den totala celler och är huvudsakliga förökar celltyp 9. Under nästan två decennier har forskare visat Na V kanaler uttrycks i en subpopulation av OPCs och kan aktiveras vid depolarisering 10, 11. Dessutom var en nyligen slående iakttagelse 9 som i de situ råtta CNS vita substansen, OPC (~ 50%) som genereras aktionspotentialer när depolarized beroende på uttryck av spänningskänsliga natrium (Na V) kanaler, och därmed kan delas in spiking och nonspiking subpopulationer. Men funktionerna för dessa tillsatta egenskaper är fortfarande till stor del okända. Vi fann att elektrofysiologi, var Mesc-derived OPCs differentieras med Shh-beroende-protokollet, inte samma som på plats hjärnan OPCs. Efter att införa subenhet Na V 1,2, var dessa tysta Mesc-derived OPCs kan spetsa.
Således kan tillsatta / nonspiking Mesc som härrör OPCs och differentiering protokoll beskrivs här underlättar (1) att studera funktionella skillnader mellan tillsatta och nonspiking OPCs, (2) screening nya faktorer som kan främja uttryck natrium kanal i Mesc som härrör OPCs, ( 3) utveckla och optimera differentiering protokollet för OPCs från mänskliga ESC eller inducerade pluripotenta stamceller (iPSCs).
The authors have nothing to disclose.
Detta arbete delvis finansierats med bidrag till WD från National Institutes of Health (RO1 NS059043 och RO1 ES015988), National Multiple Sclerosis Society, Roche Stiftelsen för anemi Forskning, Feldstein Medical Foundation och Shriners sjukhus för barn.
Vi vill tacka Dr David Pleasure och Jennifer Plane för förslag. Vi förklarar inga konkurrerande intressen med anknytning till denna artikel.
Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
---|---|---|---|---|
MEFs | GlobalStem | GSC-6001G | ||
TrypLE Express | Invitrogen | 12604 | ||
Retinoic acid | Sigma | R-2625 | ||
Purmorphamine | Cayman Chemical | 10009634 | ||
FGF-2 | Millipore | GF003 | ||
BacMam NaV 1.2 | Invitrogen | B10341 |