Маркировка и работы с изображениями Ячейки в задний мозг данио рерио
Summary
Ключ к пониманию морфогенетических процессов, которые формируют раннего эмбриона является способность ячеек изображения с высоким разрешением. Мы описываем здесь технику для маркировки отдельных клеток или небольших скоплений клеток в целом эмбрионов данио с мембраной ориентированных зеленый флуоресцентный белок.
Abstract
Ключ к пониманию морфогенетических процессов, которые формируют раннего эмбриона позвоночных является способность ячеек изображения с высоким разрешением. В данио эмбрионов, введение плазмиды результаты ДНК в мозаике выражение, что позволяет визуализировать отдельные клетки или небольшие скопления клеток<sup> 1</sup>. Мы опишем, как введение плазмиды, кодирующей ДНК, мембраны ориентированных зеленый флуоресцентный белок (mGFP) под контролем вездесущий промоутер может быть использована для работы с изображениями клетки проходят нейруляции. Центральное место в этой протокол методологии для работы с изображениями меченых клеток с высоким разрешением в разделах, а также в режиме реального времени. Этот протокол предусматривает введение ДНК mGFP в молодых эмбрионов данио. Эмбрионы затем обрабатываются для vibratome секционирования, антитела, маркировки и обработки изображений с конфокальной микроскопии. Кроме того, живых эмбрионов выражения mGFP могут быть отображены использованием покадровой конфокальной микроскопии. Ранее мы уже использовали этот простой подход для анализа поведения, которые сотовой диск нейронных формирование трубки в области заднего мозга эмбрионов данио рерио<sup> 2</sup>. Фиксированных препаратах позволила беспрецедентная визуализации клеточных форм и организации в нервной трубки в то время как живого изображения дополняется такой подход позволяет лучше понять клеточной динамики, которые имеют место во время нейруляции.
Protocol
Discussion
В заключение маркировки методов, описанных здесь, позволяют одном анализе ячейки морфогенетических процессов в данио эмбриона. Основной акцент этого протокола является по методам визуализации меченых клеток в нервной трубки использованием mGFP под контролем вездесущий промоутер. Для …
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была поддержана NIH грант присужден R. Брюстер (1R01GM085290-01A1).
Materials
Solutions
- Hank’s Stock #1: 8.0 g NaCl , 0.4 g KCl in 100 ml dd H2O
- Hank’s Stock #2: 0.358 g Na2HPO4 Anhydrous, 0.60 g KH2PO4 in 100 ml ddH2O
- Hank’s Stock #4: 0.72 g CaCl2 in 50 ml ddH2O
- Hank’s Stock #5: 1.23 g MgSO4x7H2O in 50 ml dd H2O
- 1 X Phosphate Buffer: 0.8% NaCl, 0.02% KCl, 0.02 M PO4, pH 7.3
- Blocking Solution: 2% normal goat serum, 1% bovine serum albumin (BSA), 1% dimethysulfoxide (DMSO)
Referências
- Nüsslein-Volhard, C., Dahm, R. . Zebrafish Practical approach series. , (2002).
- Hong, E., Brewster, R. N-cadherin is required for the polarized cell behaviors that drive neurulation in the zebrafish. Development. 133, 3895-3905 (2006).
- Andersen, E., Asuri, N., Clay, M., Halloran, M. Live Imaging of Cell Motility and Actin Cytoskeleton of Individual Neurons and Neural Crest Cells in Zebrafish Embryos. J Vis Exp. , (2010).
