Imágenes de vivo de los cultivos transgénicos parásitos Leishmania en un host en vivo
Summary
Un<em> In vivo</em> Sistema de imagen se utiliza para generar mediciones cuantitativas de la infección murina con los protozoos tripanosomátidos<em> Leishmania</em>. Este es un método no invasivo y no letales para la detección de parásitos que expresan luciferasa en muchos tejidos en el curso de las enfermedades crónicas<em> Leishmania</em> Spp. infección.
Abstract
Distintas especies de<em> Leishmania,</em> Un protozoo parásito de la familia<em> Trypanosomatidae</em>, Suelen causar diferentes manifestaciones de la enfermedad humana. Las formas más comunes de la enfermedad son la leishmaniasis visceral (LV) y la leishmaniasis cutánea (LC). Los modelos de ratón de la leishmaniasis son ampliamente utilizados, pero la cuantificación de la carga de parásitos durante la enfermedad requiere murino ratones que ser sacrificados en varias ocasiones después de la infección. Cargas parasitarias son medidos ya sea por microscopía, la limitación de ensayo de dilución, o la amplificación de ADN del parásito qPCR. La<em> In vivo</em> Sistema de imágenes (IVIS) tiene un paquete de software integrado que permite la detección de una señal bioluminiscente asociadas a las células en los organismos vivos. Tanto para minimizar el uso de los animales y para seguir a una infección de forma longitudinal en las personas, en modelos in vivo para las imágenes<em> Leishmania</em> Spp. causando VL o CL se establecieron. Los parásitos fueron modificados para expresar la luciferasa, y éstos se introdujeron en los ratones ya sea por vía intradérmica o intravenosa. Las mediciones cuantitativas de la bioluminiscencia de conducción luciferasa de los transgénicos<em> Leishmania</em> Parásitos dentro del ratón se realiza mediante IVIS. Ratones individuales se pueden visualizar varias veces durante los estudios longitudinales, lo que nos permite evaluar la variación inter-animal en la inoculación del parásito experimental inicial, y para evaluar la multiplicación de los parásitos en tejidos de ratón. Los parásitos se detectan con una alta sensibilidad en lugares cutáneos. Aunque es muy probable que la señal (fotones / segundo / parásito) es menor en los órganos viscerales profundos que la piel, pero las comparaciones cuantitativas de las señales de superficial en comparación con los sitios profundos no se han hecho. Es posible que el número de parásitos entre las partes del cuerpo no se pueden comparar directamente, aunque la carga de parásitos en los mismos tejidos pueden ser comparados entre los ratones. Ejemplos de una especie visceralizing (<em> L. infantum chagasi</em>) Y una especie que causa la leishmaniasis cutánea (<em> L. mexicana</em>) Se muestran. El procedimiento de IVIS pueden ser utilizados para el seguimiento y análisis de modelos de animales pequeños de una amplia variedad de<em> Leishmania</em> Especies causantes de las diferentes formas de la leishmaniasis humana.
Protocol
Discussion
El sistema de imágenes de vivo (IVIS) proporciona un método para obtener imágenes de animales enteros o en vivo modelos de infección experimental de imágenes de diferentes formas de leishmaniasis. 18,16 La spp Leishmania. los parásitos pueden ser modificados para expresar la luciferasa de luciérnaga en un nivel que se detecta en vivo con la tecnología de imagen IVIS. Una de las principales ventajas de este método es que permite la visualización no invasiv…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue financiado en parte por una subvención de revisión al Mérito del Departamento de Asuntos de Veteranos, por las subvenciones del NIH AI045540, AI067874, AI076233-01 y AI080801 (MEW), y por AI29646 (SMB). El trabajo fue realizado en parte en la financiación de la TC y la JG por el NIH T32 AI07511.
Materials
| Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| D-Luciferin Potassium Salt | Reagent | Caliper LifeSciences (Formerly Xenogen) | 122796 | |
| IVIS Imaging System 200 Series | Equipment | Caliper LifeSciences | Other IVIS models that can be used include: Lumina II, Lumina XR, Kinetic, and Spectrum. |
Referências
- Capul, A. A., Barron, T., Dobson, D. E., Turco, S. J., Beverley, S. M. Two functionally divergent UDP-Gal nucleotide sugar transporters participate in phosphoglycan synthesis in Leishmania major. J Biol Chem. 282, 14006-14017 (2007).
- LeBowitz, J. H., Coburn, C. M., McMahon-Pratt, D., Beverley, S. M. Development of a stable Leishmania expression vector and application to the study of parasite surface antigen genes. Proc Natl Acad Sci U S A. 87, 9736-9740 (1990).
- Mureev, S., Kushnir, S., Kolesnikov, A. A., Breitling, R., Alexandrov, K. Construction and analysis of Leishmania tarentolae transgenic strains free of selection markers. Mol Biochem Parasitol. 155, 71-83 (2007).
- Chakkalath, H. R. Priming of a beta-galactosidase (beta-GAL)-specific type 1 response in BALB/c mice infected with beta-GAL-transfected Leishmania major. Infect Immun. 68, 809-814 (2000).
- Sacks, D. L., Perkins, P. V. Identification of an infective stage of Leishmania promastigotes. Science. 223, 1417-1419 (1984).
- da Silva, R., Sacks, D. L. Metacyclogenesis is a major determinant of Leishmania promastigote virulence and attenuation. Infect Immun. 55, 2802-2806 (1987).
- Spath, G. F., Beverley, S. M. A lipophosphoglycan-independent method for isolation of infective Leishmania metacyclic promastigotes by density gradient centrifugation. Exp Parasitol. 99, 97-103 (2001).
- Scott, P., Caspar, P., Sher, A. Protection against Leishmania major in BALB/c mice by adoptive transfer of a T cell clone recognizing a low molecular weight antigen released by promastigotes. J Immunol. 144, 1075-1079 (1990).
- Belkaid, Y. The role of interleukin (IL)-10 in the persistence of Leishmania major in the skin after healing and the therapeutic potential of anti-IL-10 receptor antibody for sterile cure. J Exp Med. 194, 1497-1506 (2001).
- Wilson, M. E. Local suppression of IFN-gamma in hepatic granulomas correlates with tissue-specific replication of Leishmania chagasi. J Immunol. 156, 2231-2239 (1996).
- McElrath, M. J., Murray, H. W., Cohn, Z. A. The dynamics of granuloma formation in experimental visceral leishmaniasis. J Exp Med. 167, 1927-1937 (1988).
- Ato, M. Loss of dendritic cell migration and impaired resistance to Leishmania donovani infection in mice deficient in CCL19 and CCL21. J Immunol. 176, 5486-5493 (2006).
- Ahmed, S. Intradermal infection model for pathogenesis and vaccine studies of murine visceral leishmaniasis. Infect Immun. 71, 401-410 (2003).
- Kamala, T. Hock immunization: a humane alternative to mouse footpad injections. J Immunol Methods. 328, 204-214 (2007).
- Lang, T., Goyard, S., Lebastard, M., Milon, G. Bioluminescent Leishmania expressing luciferase for rapid and high throughput screening of drugs acting on amastigote-harbouring macrophages and for quantitative real-time monitoring of parasitism features in living mice. Cell Microbiol. 7, 383-392 (2005).
- Brittingham, A., Miller, M. A., Donelson, J. E., Wilson, M. E. Regulation of GP63 mRNA stability in promastigotes of virulent and attenuated Leishmania chagasi. Mol Biochem Parasitol. 112, 51-59 (2001).
- Roy, G. Episomal and stable expression of the luciferase reporter gene for quantifying Leishmania spp. infections in macrophages and in animal models. Mol Biochem Parasitol. 110, 195-206 (2000).
- Contag, C. H. Photonic detection of bacterial pathogens in living hosts. Mol Microbiol. 18, 593-603 (1995).
- Hardy, J., Margolis, J. J., Contag, C. H. Induced Biliary Excretion of Listeria monocytogenes. Infect. Immun. 74, 1819-1827 (2006).
- Lecoeur, H. Optimization of Topical Therapy for Leishmania major Localized Cutaneous Leishmaniasis Using a Reliable C57BL/6 Model. PLoS Negl Trop Dis. 1, e34-e34 (2007).
- Lang, T., Lecoeur, H., Prina, E. Imaging Leishmania development in their host cells. Trends Parasitol. 25, 464-473 (2009).
