Beredning av Drosophila S2 celler för ljusmikroskop
Summary
Drosophila Schneider (S2) celler är ett allt populärare system för upptäckt och funktionell analys av gener. Vårt mål är att beskriva några av de mikroskopiska tekniker som gör S2 celler såsom en allt viktigare experimentellt system.
Abstract
Det idealiska experimentella system skulle vara billig och lätt att underhålla, som lämpar sig för olika tekniker, och skulle stödjas av en omfattande litteratur och arvsmassa databas. Odlade Drosophila S2 celler, en produkt av skiljas 20-24 timmar gamla embryon 1, har alla dessa egenskaper. Följaktligen S2 celler är mycket väl lämpad för analys av cellulära processer, inklusive upptäckten av gener som kodar för de molekylära komponenterna i processen eller mekanism av intresse. Funktionerna i S2 celler som är mest ansvariga för deras nytta är den lätthet med vilken de underhålls, deras utsökta känslighet för dubbel-strängat (DS) RNA-medierad interferens (RNAi), och deras spårbarhet för att fluorescensmikroskopi som antingen bor eller fast celler.
S2 celler kan odlas i en mängd olika medier, inklusive ett antal billiga, kommersiellt tillgänglig, fullt definierat, serum-fria medier 2. Dessutom växer de optimalt och snabbt vid 21-24 ° C och kan odlas i en mängd olika behållare. Till skillnad från däggdjursceller, kräver S2 celler inte är en reglerad atmosfär, utan istället göra bra med vanlig luft och kan även hållas i slutna kärl.
Som komplement till enkel RNAi i S2 celler är förmågan att snabbt analysera experimentellt inducerad fenotyper av fas eller fluorescensmikroskopi av fasta eller levande celler. S2 celler växer i kultur som ett enda monolager men visa inte kontakt hämning. Istället celler tenderar att växa i kolonier i täta kulturer. Vid låga densitet, S2 kulturer som odlas på glas eller vävnadsodling behandlade plast är runda och löst bifogade. Däremot kan cytologi på S2 celler bli mycket bättre genom att få dem att platta i stor utsträckning av kort odling dem på en yta belagd med lectin, concanavalin A (Cona) 3. S2 celler kan också vara stabilt transfererats med fluorescerande-märkta markörer för att märka strukturer och organeller av intresse i levande eller fasta celler. Därför är det vanliga scenariot för mikroskopisk analys av celler här: för det första S2 celler (som kan ha transgener uttrycka taggade markörer) behandlas med RNAi för att eliminera ett målprotein (s). RNAi behandlingstiden kan justeras för att möjliggöra för skillnader i protein omsättning kinetik och för att minimera cell trauma / dödsfall om målprotein är viktigt för lönsamheten. Vidare är de behandlade cellerna överföras till en maträtt som innehåller ett täckglas före belagda med Cona att få celler att sprida och tätt följa glaset. Slutligen celler avbildas med forskaren val av mikroskopi lägen. S2 celler är särskilt bra för studier som kräver längre visualisering av levande celler eftersom dessa celler hålla sig frisk i rumstemperatur och normal atmosfär.
Protocol
Discussion
För cellbiologi området, skulle ett idealiskt system vara billig att underhålla, lätt att manipulera, och kan bli föremål för en mängd olika tekniker. Drosophila S2 celler uppfyller dessa krav, och så de har snabbt blivit det system med valet för ett växande antal celler biologi labb.
Vi har presenterat en kort översikt av de metoder för att förbereda S2 celler för mikroskopi. En anmärkningsvärd kraft av S2 celler är att de växer bra i normal atmosfär och rumstem…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete stöddes delvis av National Cancer Institute P30 CA23074, American Cancer Society Institutional Research Grant 74-001-31, och Univ.. Arizona GI SPORE (GNI / NIH CA9506O).
Materials
| Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| S2 cells | ATCC | CRL-1963 | http://www.atcc.org/ | |
| S2 cells | DGRC | stock number 6 | https://dgrc.cgb.indiana.edu/ | |
| S2 cells | Invitrogen | R690-07 | ||
| Sf900 II | Invitrogen | 10902-096 | serum-free medium | |
| HyClone SFX-Insect | Thermo Scientific | SH30278 | serum-free medium | |
| Insect-Xpress | BioWhittaker | 12-730 | serum-free medium | |
| Schneider’s S2 medium | Invitrogen | 11720-034 | Add 10% (final) heat-inactivated FBS to make complete medium. | |
| Fetal bovine serum | Invitrogen | 10438026 | heat inactivated | |
| 100x antibiotic solution | MP Biomedicals | 91674049 | contains penicillin (10000 U/mL), streptomycin (10000 μg/mL), and amphotericin B (25 μg/mL) |
|
| Concanavalin A | MP Biomedicals | 195283 | ||
| Formaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15714 | 32% solution | |
| Methanol | Mallinckrodt Baker | 9049 | anhydrous, ACS grade | |
| Molecular sieves | Acros Organics | 19724 | type 3A |
Referências
- Schneider, I. Cell lines derived from late embryonic stages of Drosophila melanogaster. J Embryol Exp Morphol. 27, 353-365 (1972).
- Rogers, S. L., Rogers, G. C. Culture of Drosophila S2 cells and their use for RNAi-mediated loss-of-function studies and immunofluorescence microscopy. Nat Protoc. 3, 606-611 (2008).
- Rogers, S. L., Rogers, G. C., Sharp, D. J., Vale, R. D. Drosophila EB1 is important for proper assembly, dynamics, and positioning of the mitotic spindle. J Cell Biol. 158, 873-884 (2002).
- Goshima, G. Genes required for mitotic spindle assembly in Drosophila S2 cells. Science. 316, 417-421 (2007).
