Vorbereitung der Drosophila S2-Zellen für Lichtmikroskopie
Summary
Drosophila Schneider (S2) Zellen sind ein zunehmend beliebtes System für die Entdeckung und funktionelle Analyse von Genen. Unser Ziel ist es, einige der mikroskopischen Techniken, die S2-Zellen zu machen, wie eine zunehmend wichtige experimentelle System zu beschreiben.
Abstract
Die ideale experimentelles System wäre billig und leicht zu pflegen, zugänglich für eine Vielzahl von Techniken und würde durch eine umfangreiche Literatur-und Genom-Sequenz-Datenbank unterstützt werden. Cultured Drosophila S2-Zellen, das Produkt der distanzierte 20-24 Stunden alte Embryonen 1, besitzen alle diese Eigenschaften. Folglich sind S2-Zellen extrem für die Analyse von zellulären Prozessen, einschließlich der Entdeckung der Gene, die molekularen Komponenten des Prozesses oder der Mechanismus von Interesse gut geeignet. Die Features von S2-Zellen, die die größte Verantwortung für deren Nutzen sind, sind die Leichtigkeit, mit der sie gehalten werden, ihren exquisiten Sensibilität für doppelsträngige (ds) RNA-Interferenz (RNAi), und ihre Handhabbarkeit zu Fluoreszenzmikroskopie als entweder live oder feste Zellen.
S2-Zellen können in einer Vielzahl von Medien gezüchtet werden, darunter eine Reihe von preiswerten, handelsüblichen, vollständig definierte, Serum-freien Medien 2. Darüber hinaus wachsen sie optimal und schnell auf 21-24 ° C und kann in einer Vielzahl von Containern kultiviert werden. Im Gegensatz zu Säugerzellen tun S2-Zellen benötigen kein geregelter Atmosphäre, sondern tun auch mit normaler Luft und können sogar in verschlossenen Flaschen aufrechterhalten werden.
Ergänzend zu der einfachen RNAi in S2-Zellen ist die Fähigkeit, leicht zu analysieren experimentell induzierten Phänotypen von Phase oder Fluoreszenzmikroskopie von festen oder lebenden Zellen. S2 Zellen wachsen in Kultur als eine einzige Monolage aber nicht angezeigt, wenden Sie Hemmung. Stattdessen neigen Zellen in Kolonien in dichten Kulturen wachsen. Bei geringer Dichte, S2 Kulturen auf Glas-oder Gewebekultur-behandelte Kunststoff gewachsen sind rund und lose befestigt. Allerdings kann die Zytologie von S2-Zellen stark durch die sie dazu veranlassen weitgehend flach durch kurzes kultiviert auf einer Fläche mit dem Lektin Concanavalin A (ConA) 3 beschichtet verbessert werden. S2-Zellen können auch stabil mit Fluoreszenz-markierten Marker zu beschriften Strukturen oder Organellen Interesse an Live-oder fixierten Zellen transfiziert werden. Daher ist das Szenario für die mikroskopische Analyse von Zellen: Erstens, S2-Zellen (die Transgene mit Tags Marker zum Ausdruck besitzen) werden durch RNAi behandelt, um ein Zielprotein (s) zu beseitigen. RNAi-Behandlung Zeit kann eingestellt werden, um Unterschiede in Protein zu ermöglichen turn-over-Kinetik und die Zelle Trauma / Tod zu minimieren, wenn das Zielprotein für die Lebensfähigkeit wichtig. Anschließend werden die behandelten Zellen zu einer Schale mit einem Deckglas vorbeschichtet mit conA, um Zellen zu verbreiten induzieren und fest mit dem Glas haften übertragen. Schließlich werden die Zellen mit dem Forscher die Wahl der Mikroskopie-Modi abgebildet. S2 Zellen sind besonders gut für Studien erfordern erweiterte Visualisierung von lebenden Zellen, da diese Zellen bei Raumtemperatur und normaler Atmosphäre gesund zu bleiben.
Protocol
Discussion
Für die Zellbiologie Feld wäre ein ideales System kostengünstig in der Wartung, leicht zu manipulieren, und zugänglich für eine Vielzahl von Techniken. Drosophila S2-Zellen erfüllen diese Anforderungen, und so haben sie schnell das System der Wahl für eine wachsende Zahl von Zellen Biologie-Labors.
Wir haben einen kurzen Überblick über die Methoden, die S2-Zellen für die Mikroskopie vorbereitet präsentiert. Eine bemerkenswerte Tugend der S2-Zellen ist die Tatsache, dass s…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde teilweise von der National Cancer Institute P30 CA23074, die American Cancer Society Institutional Research Grant 74-001-31, und der Univ unterstützt. of Arizona GI SPORE (NCI / NIH CA9506O).
Materials
| Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| S2 cells | ATCC | CRL-1963 | http://www.atcc.org/ | |
| S2 cells | DGRC | stock number 6 | https://dgrc.cgb.indiana.edu/ | |
| S2 cells | Invitrogen | R690-07 | ||
| Sf900 II | Invitrogen | 10902-096 | serum-free medium | |
| HyClone SFX-Insect | Thermo Scientific | SH30278 | serum-free medium | |
| Insect-Xpress | BioWhittaker | 12-730 | serum-free medium | |
| Schneider’s S2 medium | Invitrogen | 11720-034 | Add 10% (final) heat-inactivated FBS to make complete medium. | |
| Fetal bovine serum | Invitrogen | 10438026 | heat inactivated | |
| 100x antibiotic solution | MP Biomedicals | 91674049 | contains penicillin (10000 U/mL), streptomycin (10000 μg/mL), and amphotericin B (25 μg/mL) |
|
| Concanavalin A | MP Biomedicals | 195283 | ||
| Formaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15714 | 32% solution | |
| Methanol | Mallinckrodt Baker | 9049 | anhydrous, ACS grade | |
| Molecular sieves | Acros Organics | 19724 | type 3A |
Referências
- Schneider, I. Cell lines derived from late embryonic stages of Drosophila melanogaster. J Embryol Exp Morphol. 27, 353-365 (1972).
- Rogers, S. L., Rogers, G. C. Culture of Drosophila S2 cells and their use for RNAi-mediated loss-of-function studies and immunofluorescence microscopy. Nat Protoc. 3, 606-611 (2008).
- Rogers, S. L., Rogers, G. C., Sharp, D. J., Vale, R. D. Drosophila EB1 is important for proper assembly, dynamics, and positioning of the mitotic spindle. J Cell Biol. 158, 873-884 (2002).
- Goshima, G. Genes required for mitotic spindle assembly in Drosophila S2 cells. Science. 316, 417-421 (2007).
