Preparazione del Drosophila Cellule S2 per la microscopia ottica
Summary
Drosophila Schneider (S2), le cellule sono un sistema sempre più popolare per la scoperta e l'analisi funzionale dei geni. Il nostro obiettivo è quello di descrivere alcune delle tecniche microscopiche, che le cellule S2 ad un sistema sempre più importante sperimentale.
Abstract
Il sistema sperimentale ideale sarebbe economico e facile da mantenere, suscettibile di una varietà di tecniche, e sarebbe sostenuto da una vasta letteratura e la sequenza del genoma del database. Colture di cellule di Drosophila S2, il prodotto di dissociato 20-24 ore embrioni vecchio 1, in possesso di tutte queste caratteristiche. Di conseguenza, le cellule S2 sono estremamente adatti per l'analisi dei processi cellulari, tra cui la scoperta dei geni che codificano per i componenti molecolari del processo o meccanismo di interesse. Le caratteristiche delle cellule S2 che sono più responsabili per la loro utilità è la facilità con cui vengono gestiti, la loro squisita sensibilità a doppio filamento (ds) RNA-mediata interference (RNAi), e la loro trattabilità di microscopia a fluorescenza come sia vivo o fissa cellule.
S2 cellule possono essere coltivate in una varietà di supporti, tra cui un certo numero di basso costo, disponibili in commercio, completamente definito, privo di siero dei media 2. Inoltre, crescono in modo ottimale e rapido a 21-24 ° C e può essere coltivato in una varietà di contenitori. A differenza delle cellule dei mammiferi, le cellule S2 non richiedono un ambiente regolamentato, ma invece fare bene con l'aria normale e può anche essere mantenuto in contenitori sigillati.
Completando la facilità di RNAi in cellule S2 è la capacità di analizzare facilmente fenotipi sperimentalmente indotta dalla fase o microscopia a fluorescenza di cellule fisse o dal vivo. Cellule S2 crescere in cultura come un monostrato unico, ma non vengono visualizzati inibizione da contatto. Al contrario, le cellule tendono a crescere in colonie nelle culture dense. A bassa densità, le culture S2 cresciuti su vetro o dei tessuti trattati con la cultura di plastica sono rotonde e vagamente-attached. Tuttavia, la citologia delle cellule S2 può essere notevolmente migliorata inducendoli ad appiattire estensivamente da colture brevemente su una superficie ricoperta con la lectina, concanavalina A (ConA) 3. Cellule S2 può anche essere stabilmente transfettate con marcatori fluorescenti-tag alle strutture etichetta o organelli di interesse in cellule vive o fissi. Pertanto, lo scenario consueto per l'analisi microscopica delle cellule è questa: primo, le cellule S2 (che può possedere transgeni di esprimere marcatori tag) sono trattati con RNAi per eliminare una proteina bersaglio (s). Tempo di trattamento RNAi può essere regolata per tener conto delle differenze di proteine turn-over cinetica e di ridurre al minimo il trauma cellulare / morte se la proteina bersaglio è importante per la vitalità. Successivamente, le cellule trattate vengono trasferiti in un piatto contenente un coprioggetto preverniciato con Ancona per indurre le cellule a diffondere e strettamente aderire al vetro. Infine, le cellule sono ripreso con la scelta del ricercatore di modalità di microscopia. Cellule S2 sono particolarmente buoni per gli studi che richiedono la visualizzazione estesa di cellule vive da quando queste cellule rimanere in buona salute a temperatura ambiente e l'atmosfera normale.
Protocol
Discussion
Per il settore della biologia cellulare, un sistema ideale dovrebbe essere poco costoso da mantenere, facile da manipolare, e suscettibili di una varietà di tecniche. Cellule di Drosophila S2 soddisfare questi requisiti, e quindi hanno rapidamente diventato il sistema di scelta per un numero crescente di cellulari laboratori di biologia.
Abbiamo presentato una breve panoramica dei metodi per preparare le cellule S2 per microscopia. Una virtù notevole di cellule S2 è il fatto che …
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato sostenuto in parte dal National Cancer Institute P30 CA23074, l'American Cancer Society Research istituzionali di Grant 74-001-31, e l'Univ. dell'Arizona GI SPORE (NCI / NIH CA9506O).
Materials
| Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| S2 cells | ATCC | CRL-1963 | http://www.atcc.org/ | |
| S2 cells | DGRC | stock number 6 | https://dgrc.cgb.indiana.edu/ | |
| S2 cells | Invitrogen | R690-07 | ||
| Sf900 II | Invitrogen | 10902-096 | serum-free medium | |
| HyClone SFX-Insect | Thermo Scientific | SH30278 | serum-free medium | |
| Insect-Xpress | BioWhittaker | 12-730 | serum-free medium | |
| Schneider’s S2 medium | Invitrogen | 11720-034 | Add 10% (final) heat-inactivated FBS to make complete medium. | |
| Fetal bovine serum | Invitrogen | 10438026 | heat inactivated | |
| 100x antibiotic solution | MP Biomedicals | 91674049 | contains penicillin (10000 U/mL), streptomycin (10000 μg/mL), and amphotericin B (25 μg/mL) |
|
| Concanavalin A | MP Biomedicals | 195283 | ||
| Formaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15714 | 32% solution | |
| Methanol | Mallinckrodt Baker | 9049 | anhydrous, ACS grade | |
| Molecular sieves | Acros Organics | 19724 | type 3A |
Referências
- Schneider, I. Cell lines derived from late embryonic stages of Drosophila melanogaster. J Embryol Exp Morphol. 27, 353-365 (1972).
- Rogers, S. L., Rogers, G. C. Culture of Drosophila S2 cells and their use for RNAi-mediated loss-of-function studies and immunofluorescence microscopy. Nat Protoc. 3, 606-611 (2008).
- Rogers, S. L., Rogers, G. C., Sharp, D. J., Vale, R. D. Drosophila EB1 is important for proper assembly, dynamics, and positioning of the mitotic spindle. J Cell Biol. 158, 873-884 (2002).
- Goshima, G. Genes required for mitotic spindle assembly in Drosophila S2 cells. Science. 316, 417-421 (2007).
