I denna video visar vi effektivt elektroniskt av celler<em> In vitro</em> Med hjälp av modifierade följsamhet metod med elektroporation och den efterföljande detektion av smält celler visualisering med fluorescensmikroskopi.
Cell elektrosvetsade är en säker, icke-virala och icke-kemisk metod som kan användas för att förbereda hybrid celler för behandling av människor. Elektrosvetsade innebär användandet av korta högspänd elektriska pulser till celler som är i nära kontakt. Tillämpning av korta, högspända elektriska pulser orsaker till destabilisering av cellmembran plasma. Destabiliserat membran är mer genomsläpplig för olika molekyler och också benägna att fusion med någon destabiliserat angränsande membran. Elektrosvetsade är alltså en bekväm metod för att uppnå en icke-specifik blandning av mycket olika celler<em> In vitro</em>. För att få fusion, cellmembran, destabiliseras av elektriska fält, måste vara i nära kontakt för att möjliggöra sammanslagning av deras lipid bilayers och därmed deras cytoplasman. I denna video visar vi effektivt elektroniskt av celler<em> In vitro</em> Med hjälp av modifierade följsamhet metod. I denna metod är celler tillåtelse att ansluta något till ytan av bra, så att mediet kan utbytas och celler fortfarande bevara sin sfäriska form. Fusion visualisering bedöms av pre-märkning av cytoplasman av celler med olika fluorescerande färger cellen trackern, hälften av cellerna är märkta med orange CMRA och den andra hälften med gröna CMFDA. Fusion avkastningen bestäms som det antal för sig fluorescerande celler delas med antalet alla celler multiplicerat med två.
Förmåga cellmembran att smälta icke-specifikt, t.ex. av yttre elektriska fält, är viktigt för bioteknik, medicin och forskning inom biologi. Sådana ospecifik fusion möjliggör produktion av mycket värdefulla hybrid celler och deras produkter, såsom monoklonala antikroppar, och ger information om grundläggande mekanismer för fusionsenergi [2]. Elektrosvetsade är en potentiellt mycket effektiv metod eftersom det kan vara rätt anpassas till olika typer av celler. Elektrosvetsade uppnås när celler i nära fysisk kontakt förs in i deras fusogenic tillstånd (som lätt kan fusion) med hjälp av högspänd elektriska pulser. Effektiviteten i elektrosvetsning beror på olika parametrar som påverkar två delar av elektrosvetsning processen. Första delen av elektrosvetsning processen är uppnåendet av nära fysisk kontakt mellan celler, som kan erhållas med olika metoder [3-8]. Respekt metoden (växande celler till sammanflödet) kan användas effektivt på grund av spontant etablerade cellkontakter i stora zoner mellan cellerna, men ger det mycket stora smält celler med många kärnor. Vi använder den modifierade följsamhet metoden, där mindre celler (med 2 till 5 kärnor), vilka är mer benägna att överleva och föröka sig, erhålls (figur 1). Kontakt mellan celler drar också nytta osmotisk svullnad av celler, på grund av osmotiska behandling som används i försöket [9]. Andra delen av elektrosvetsning processen är att uppnå fusogenic tillståndet i cellmembranen. Fusogenic staten korrelerar väl med electropermeabilized tillstånd av membranet (celler ospecifikt permeabilized att molekyler som normalt inte kan passera genom intakt membran) och styrs av samma parametrar i elektriska pulser (amplitud, längd, antal och frekvens) [10] . Värdena för elektriska parametrar som behövs för optimal elektroporation [1] och elektrosvetsning skiljer sig mellan olika celler och är beroende av celler storlek och deras biologiska egenskaper. Elektriska parametrar måste därför vara optimerade för olika cellinjer, som används som fusion partner, för att få fusion.
The authors have nothing to disclose.
Detta arbete stöddes av det slovenska forskningsinstitut (projekt J2-9764 och program P2-0249). Denna video är kompletterande material för "elektroporation-baserade tekniker och behandlingar" vetenskapliga verkstad och magisterexamen, som anordnas av fakulteten för elektroteknik vid universitetet i Ljubljana, Slovenien.
Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
---|---|---|---|---|
CMRA | Reagent | Invitrogen | C34551 | Cytosolic fluorescent dye |
CMFDA | Reagent | Invitrogen | C7025 | Cytosolic fluorescent dye |
DMSO | Reagent | Sigma-Aldrich | D2650 | |
DMEM | Reagent | Sigma-Aldrich | D5671 | Dulbecco’s modified Eagle’s medium |
Fetal calf serum | Reagent | Sigma-Aldrich | F4135 | |
L-glutamine | Reagent | Sigma-Aldrich | G7513 | |
crystacillin | Reagent | Pliva | 625110 | antibiotic |
gentamicin | Reagent | Sigma-Aldrich | G1397 | antibiotic |
Hepes | Reagent | Sigma-Aldrich | H0887 | |
KH2PO4 | Reagent | Merck | A124873 927 | |
KH2PO4 | Reagent | Sigma-Aldrich | 4248 | |
MgCl2 | Reagent | Sigma-Aldrich | M-8266 | |
NaCl | Reagent | Fluka | 71382 | |
KCl | Reagent | Merck | A154336 908 | |
MgSO4 | Reagent | Sigma-Aldrich | M2643 | |
D-glucose | Reagent | Sigma-Aldrich | G8270 | |
CaCl2 | Reagent | Sigma-Aldrich | C4901 | |
sucrose | Reagent | Sigma-Aldrich | 16104 | |
Electric pulse generator | Tool | Igea | Cliniporator VITAE | |
Multiwell plate | Tool | TPP | 92424 | |
50 ml centrifuge tube | Tool | TPP | 91050 | |
15 ml centrifuge tube | Tool | TPP | 91015 | |
25 cm2 culture flask | Tool | TPP | 90026 | |
Electrodes | Tool | Custom made | Pt/Ir |