Photoconversion van gezuiverde fluorescerende eiwitten en dual-probe optische markering in levende cellen
Summary
Dit protocol beschrijft een algemene aanpak voor photoconversion van fluorescerende eiwitten te voeren op een confocale laser scanning microscoop. We beschrijven de procedures voor de photoconversion van puried eiwit monsters, evenals voor dual-probe optische markeren in levende cellen met mOrange2 en Dronpa.
Abstract
Photoconvertible fluorescerende eiwitten (pc-KP's) zijn een klasse van fluorescerende eiwitten met "optische highlighter"-mogelijkheid, wat betekent dat de kleur van de fluorescentie kan worden veranderd door blootstelling aan licht van een specifieke golflengte. Optische highlighting maakt niet-invasieve markering van een subpopulatie van fluorescerende moleculen, en is daarom ideaal voor het opsporen van enkele cellen of organellen.
Kritische parameters voor een efficiënte photoconversion zijn de intensiteit en de belichtingstijd van de photoconversion licht. Als de intensiteit te laag is, zal photoconversion worden langzaam of niet optreden op alle. Aan de andere kant kan te veel intensiteit of te lange blootstelling photobleach het eiwit en daardoor verminderen de efficiëntie van de photoconversion.
Dit protocol beschrijft een algemene aanpak van het opzetten van een confocale laser scanning microscoop voor pc-FP photoconversion toepassingen. Eerst beschrijven we een procedure voor het bereiden van gezuiverde eiwit druppel monsters. Dit monster formaat is erg handig voor het bestuderen van de fotofysische gedrag van fluorescerende eiwitten onder de microscoop. Ten tweede, zullen we gebruik maken van de eiwit druppel monster te laten zien hoe de microscoop voor photoconversion configureren. En tot slot, laten we zien hoe de optische markering uit te voeren in levende cellen, inclusief dual-probe optische markeren met mOrange2 en Dronpa.
Protocol
Discussion
Het gezuiverde fluorescerend eiwit druppel monster is een zeer handige sample-indeling voor de fotofysische karakterisering van fluorescerende eiwitten, bijvoorbeeld om te studeren fotobleken kinetiek en photoconversion kinetiek. De extreem kleine druppels volume (~ 20 picoliter) faciliteert fotobleken en photoconversion experimenten, die kan moeilijk zijn uit te voeren in de cuvette gebaseerde systemen. Daarnaast, zoals hier de druppel monster is bij uitstek geschikt voor het opzetten van een confocale microscoop voor …
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wij danken Mike W. Davidson (Florida State University) voor het leveren van plasmide DNA dat codeert voor fluorescerende eiwitten. Dit werk werd ondersteund door National Institutes of Health te verlenen GM72048 (tot DWP).
Materials
| Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Microsope slides | VWR Scientific | 48312-003 | ||
| 22 mm cover glass | Corning | 2940-245 | ||
| 1-octanol | Sigma | O4500 | ||
| methyltrimethoxysilane | Sigma | M6420 | ||
| MatTek dishes | MatTek Corp. | P35G-1.5-14-C | ||
| Lipofectamine2000 | Invitrogen | 11668-019 |
Referências
- Kremers, G. J., Hazelwood, K. L., Murphy, C. S., Davidson, M. W., Piston, D. W. Photoconversion in orange and red fluorescent proteins. Nature Methods. 6, 355-358 (2009).
