Fotoconversão de proteínas purificadas fluorescentes e Dual-sonda Destacando Optical em células vivas
Summary
Este protocolo descreve uma abordagem geral para realizar fotoconversão de proteínas fluorescentes em um microscópio confocal de varredura a laser. Descrevemos os procedimentos para a fotoconversão de amostras de proteínas puried, bem como para dual-sonda destacando ópticos em células vivas com mOrange2 e Dronpa.
Abstract
Photoconvertible proteínas fluorescentes (pc-PQ) são uma classe de proteínas fluorescentes com "óptica highlighter" capacidade, o que significa que a cor da fluorescência pode ser alterada pela exposição à luz de um comprimento de onda específico. Destacando óptico não invasivo permite marcação de uma subpopulação de moléculas fluorescentes e, portanto, ideal para acompanhar uma única célula ou organelas.
Parâmetros críticos para fotoconversão eficientes são a intensidade eo tempo de exposição da luz fotoconversão. Se a intensidade é muito baixa, fotoconversão será lento ou não ocorrer. Por outro lado, a intensidade ou exposição muito muito tempo pode photobleach a proteína e, assim, reduzir a eficiência do fotoconversão.
Este protocolo descreve uma abordagem geral como configurar um microscópio laser confocal para aplicações pc-FP fotoconversão. Primeiro, vamos descrever um procedimento para a preparação de amostras de gotículas de proteína purificada. Este formato de amostra é muito conveniente para estudar o comportamento fotofísicas de proteínas fluorescentes sob o microscópio. Em segundo lugar, vamos usar o exemplo de gotículas de proteína para mostrar como configurar o microscópio para fotoconversão. E, finalmente, vamos mostrar como executar destacando óptica em células vivas, incluindo dual-sonda destacando óptica com mOrange2 e Dronpa.
Protocol
Discussion
A amostra purificada gota proteína fluorescente é um formato de amostra muito conveniente para a caracterização fotofísicas de proteínas fluorescentes, por exemplo para estudar fotobranqueamento cinética e cinética fotoconversão. O volume de gotículas extremamente pequenas (~ 20 picolitros) facilita a fotodegradação e experimentos fotoconversão, que pode ser difícil de executar em sistemas baseados cuvete. Além disso, como mostrado aqui a amostra de gota é ideal para a criação de um microscópio confoc…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos a Mike W. Davidson (Florida State University) para a prestação de DNA plasmídeo que codificam proteínas fluorescentes. Este trabalho foi financiado pelo National Institutes of Health conceder GM72048 (para DWP).
Materials
| Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Microsope slides | VWR Scientific | 48312-003 | ||
| 22 mm cover glass | Corning | 2940-245 | ||
| 1-octanol | Sigma | O4500 | ||
| methyltrimethoxysilane | Sigma | M6420 | ||
| MatTek dishes | MatTek Corp. | P35G-1.5-14-C | ||
| Lipofectamine2000 | Invitrogen | 11668-019 |
Referências
- Kremers, G. J., Hazelwood, K. L., Murphy, C. S., Davidson, M. W., Piston, D. W. Photoconversion in orange and red fluorescent proteins. Nature Methods. 6, 355-358 (2009).
