Этот протокол описывает общий подход для выполнения фотопреобразования флуоресцентных белков по конфокальной лазерной сканирующей микроскопии. Мы описываем процедуры фотопревращения puried образцов белков, а также для двойного зонда оптических подсветка в живых клетках с mOrange2 и Dronpa.
Abstract
Photoconvertible флуоресцентных белков (рс-ФПС) представляют собой класс флуоресцентных белков с "оптический маркер" возможности, а это означает, что цвет флуоресценции может быть изменен под воздействием света определенной длины волны. Оптическая подсветка позволяет неинвазивным маркировка субпопуляции флуоресцентные молекулы, и поэтому идеально подходит для отслеживания отдельных клеток или органелл.
Критические параметры для эффективного фотопреобразования являются интенсивность и время экспозиции фотопреобразования света. Если интенсивность слишком мала, фотопреобразования будет медленно или не происходит вообще. С другой стороны, слишком много интенсивности или слишком длительном воздействии может photobleach белка и тем самым снизить эффективность фотопреобразования.
Этот протокол описывает общий подход, как настроить конфокальной лазерной сканирующей микроскопии для ПК-FP приложений фотопреобразования. Во-первых, мы описываем процедуру подготовки очищенные образцы белка капли. Этот образец формат очень удобен для изучения фотофизических поведение флуоресцентных белков под микроскопом. Во-вторых, мы будем использовать образец белка капли, чтобы показать, как настроить микроскоп для фотопреобразования. И, наконец, мы покажем, как выполнить оптическую подсветку в живых клетках, в том числе двойного зонда оптических выделение с mOrange2 и Dronpa.
Protocol
1. Подготовка люминесцентные образцы капли белка Флуоресцентного белка капли образец состоит из 1-octanol/water эмульсии с флуоресцентным белком, проживающих в водной фазе. Эта эмульсия зажата между слайд микроскоп и 22 мм квадратных покровного стекла для микроскопии приложени…
Discussion
Очищенной люминесцентные образцы капли белка очень удобно типовой формат для фотофизических характеристик флуоресцентные белки, например, для исследования кинетики и фотообесцвечивания фотопреобразования кинетики. Крайне мало объема капли (~ 20 пиколитра) облегчает фотообесцвечива?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы благодарим В. Майк Дэвидсон (Университет штата Флорида) за предоставление плазмиды ДНК, кодирующий флуоресцентные белки. Работа выполнена при поддержке Национального института здоровья грант GM72048 (для ДПР).
Kremers, G., Piston, D. Photoconversion of Purified Fluorescent Proteins and Dual-probe Optical Highlighting in Live Cells. J. Vis. Exp. (40), e1995, doi:10.3791/1995 (2010).