Este protocolo descreve uma abordagem geral para realizar fotoconversão de proteínas fluorescentes em um microscópio confocal de varredura a laser. Descrevemos os procedimentos para a fotoconversão de amostras de proteínas puried, bem como para dual-sonda destacando ópticos em células vivas com mOrange2 e Dronpa.
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Artigo de método
Fotoconversão de proteínas purificadas fluorescentes e Dual-sonda Destacando Optical em células vivas
Neste artigo
Resumo
Resumo
Photoconvertible proteínas fluorescentes (pc-PQ) são uma classe de proteínas fluorescentes com "óptica highlighter" capacidade, o que significa que a cor da fluorescência pode ser alterada pela exposição à luz de um comprimento de onda específico. Destacando óptico não invasivo permite marcação de uma subpopulação de moléculas fluorescentes e, portanto, ideal para acompanhar uma única célula ou organelas.
Parâmetros críticos para fotoconversão eficientes são a intensidade eo tempo de exposição da luz fotoconversão. Se a intensidade é muito baixa, fotoconversão será lento ou não ocorrer. Por outro lado, a intensidade ou exposição muito muito tempo pode photobleach a proteína e, assim, reduzir a eficiência do fotoconversão.
Este protocolo descreve uma abordagem geral como configurar um microscópio laser confocal para aplicações pc-FP fotoconversão. Primeiro, vamos descrever um procedimento para a preparação de amostras de gotículas de proteína purificada. Este formato de amostra é muito conveniente para estudar o comportamento fotofísicas de proteínas fluorescentes sob o microscópio. Em segundo lugar, vamos usar o exemplo de gotículas de proteína para mostrar como configurar o microscópio para fotoconversão. E, finalmente, vamos mostrar como executar destacando óptica em células vivas, incluindo dual-sonda destacando óptica com mOrange2 e Dronpa.
Protocolo
1. Preparação de amostras de gotículas proteína fluorescente
Uma amostra de gota proteína fluorescente é constituída por uma emulsão 1-octanol/water com a proteína fluorescente que residem na fase aquosa. Esta emulsão está entre uma lâmina de microscópio e uma tampa de vidro 22 milímetros quadrados para aplicações de microscopia.
- Antes de fazer amostras de gotículas proteína fluorescente das lâminas e lamínulas de vidro devem ser limpas e revestidas com um agente hidrofóbico.
- Limpa vidros, lavando 5 minutos com acetona e deixar secar por via aérea. (Opcionalmente, após a limpeza do vidro pode ser tratada por 30 segund....
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Discussão
A amostra purificada gota proteína fluorescente é um formato de amostra muito conveniente para a caracterização fotofísicas de proteínas fluorescentes, por exemplo para estudar fotobranqueamento cinética e cinética fotoconversão. O volume de gotículas extremamente pequenas (~ 20 picolitros) facilita a fotodegradação e experimentos fotoconversão, que pode ser difícil de executar em sistemas baseados cuvete. Além disso, como mostrado aqui a amostra de gota é ideal para a criação de um microscópio confocal para aplicações .......
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Divulgações
Não há conflitos de interesse declarados.
Agradecimentos
Agradecemos a Mike W. Davidson (Florida State University) para a prestação de DNA plasmídeo que codificam proteínas fluorescentes. Este trabalho foi financiado pelo National Institutes of Health conceder GM72048 (para DWP).
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Lâminas de microscópio | VWR international | 48312-003 | |
| Vidro de cobertura de 22 mm | Corning | 2940-245 | |
| 1-octanol | Sigma-Aldrich | O4500 | |
| metiltrimetoxissilano | Sigma-Aldrich | M6420 | |
| Placas MatTek | MatTek Corp. | P35G-1.5-14-C | |
| Lipofectamina2000 | Invitrogen | 11668-019 |
Referências
- Kremers, G. J., Hazelwood, K. L., Murphy, C. S., Davidson, M. W., Piston, D. W. Photoconversion in orange and red fluorescent proteins. Nature Methods. 6, 355-358 (2009).
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Reimpressões e permissões
