哺乳動物細胞におけるDNA二重鎖切断（DSB）修復の解析
Summary
この記事では、GFPベースの蛍光を示して<em> in vivoで</em>別々に相同組換えを定量化し、非相同哺乳類細胞に結合する終了アッセイ。
Abstract
DNA二本鎖切断は、遺伝情報と細胞死の巨大な損失につながる可能性が最も危険なDNAの損傷です。非相同端接合（NHEJ）と相同組換え（HR）：2つの主要な経路を用いて細胞の修復DSBが。 NHEJとHRの摂動は、しばしば早期老化と腫瘍形成に関連付けられている、それゆえに各DSBの修復経路を測定する定量的な方法を持つことが重要です。当研究室では、NHEJとHRの高感度かつ定量的な測定を可能にする蛍光レポーターコンストラクトを開発しました。構文は、DSBが誘導のための珍しいカットI – SCEIのエンドヌクレアーゼの認識部位を含む工学GFPの遺伝子に基づいています。 GFP遺伝子は、追加のエクソンによって、または変異により不活性化されるように始まる構造はGFP陰性である。 NHEJまたはHRによるI – SCEI誘起ブレイクの成功修復は、機能的なGFPの遺伝子を復元します。フローサイトメトリーによってカウントGFP陽性細胞の数は、NHEJまたはHR効率の定量的な尺度を提供する。
Protocol
Discussion
蛍光NHEJとHRのレポーターアッセイでは、別々にin vivoで各DSBの修復経路を測定するための定量的な方法を提供します。 FACSは、確実に20,000細胞で10 GFP +細胞を検出することができるようなアッセイは、非常に敏感です。アッセイは、DSBの2の誘導後数分または数時間以内GFP +細胞の出現を検出することにより、"リ アルタイム"で修復イベントを測定するために適合させ?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
オリジナルのGFP – PEM1は博士レイリーから寄贈されたもの。この作品は、NIHとエリソン医学財団からVGへの補助金によってと同様にサポートされて
Materials
| Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| EndoFree Plasmid Maxi kit | Qiagen | 12362 | ||
| Qiaex II Gel Extraction Kit | Qiagen | 20021 | ||
| Amaxa Nucleofector | Lonza | AAD-1001 | ||
| Geneticin (G418) | Invitrogen | 11811-031 | ||
| pDsRed2-N1 | Clontech | 632406 | ||
| Round bottom tubes | BD Falcon | 352058 | FACS tubes |
Referências
- Mao, Z., Seluanov, A., Jiang, Y., Gorbunova, V. TRF2 is required for repair of nontelomeric DNA double-strand breaks by homologous recombination. Proc Natl Acad Sci U S A. 104, 13068-13073 (2007).
- Mao, Z., Bozzella, M., Seluanov, A., Gorbunova, V. Comparison of nonhomologous end joining and homologous recombination in human cells. DNA Repair (Amst). 7, 1765-1771 (2008).
- Rouet, P., Smih, F., Jasin, M. Expression of a site-specific endonuclease stimulates homologous recombination in mammalian cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 91, 6064-6068 (1994).
- Mao, Z., Jiang, Y., Xiang, L., Seluanov, A., Gorbunova, V. DNA repair by homologous recombination, but not by nonhomologous end joining, is elevated in breast cancer cells. Neoplasia. 11, 683-691 (2009).
- Seluanov, A., Mittelman, D., Pereira-Smith, O. M., Wilson, J. H., Gorbunova, V. DNA end joining becomes less efficient and more error-prone during cellular senescence. Proc Natl Acad Sci U S A. 101, 7624-7629 (2004).
- Mao, Z., Bozzella, M., Seluanov, A., Gorbunova, V. DNA repair by nonhomologous end joining and homologous recombination during cell cycle in human cells. Cell Cycle. 7, 2902-296 (2008).
