تحميل البضائع على مكوكات Kinesin بدعم الجزيئية
Summary
المكوكات الجزيئية التي تتكون من ميكروتثبول functionalized التزلق على سطح التزمت خدمة يمكن kinesin البروتينات السيارات كنظام النقل النانو. هنا ، هو وصف لنظام تجميع المكوك نموذجي.
Abstract
وقد تطورت الخلايا الجزيئية ، آلات متطورة ، مثل البروتينات والخيوط السيارات kinesin أنيبيب ، لدعم النقل بين الخلايا النشطة من البضائع. في حين يربط kinesins ذيل المجال لمجموعة متنوعة من البضائع ، رئيس kinesins المجالات الاستفادة من الطاقة الكيميائية المخزونة في جزيئات ATP لخطوة على أنيبيب شعرية. منذ فترة طويلة ، شديدة ميكروتثبول بمثابة مسارات للنقل لمسافات طويلة داخل الخلايا.
ويمكن أيضا هذه المحركات وشعيرات أن تستخدم في البيئات الاصطناعية microfabricated كعناصر في المكوكات الجزيئية 1. في تصميم تستخدم بشكل متكرر ، وترسو kinesin المحركات على السطح من خلال المسار ذيولها ، وميكروتثبول functionalized بمثابة شحن تحمل العناصر التي تدفعها هذه المحركات. ويمكن تحميل هذه المكوكات مع البضائع من خلال الاستفادة من الربط بين القوي وانتقائية والبيوتين streptavidin. المكونات الرئيسية (تويولين biotinylated ، streptavidin ، والبضائع biotinylated) متاحة تجاريا.
بناء على تجربة حركية مقلوب الكلاسيكية 2 ، هو مفصل في بناء المكوكات الجزيئية هنا. وكثف Kinesin البروتينات السيارات على سطح precoated مع الكازين ، ويتم بلمرة ميكروتثبول من تويولين biotinylated ، انضمت إلى kinesin والمغلفة في وقت لاحق مع streptavidin – رودامين المسمى. المحافظة على التركيز في بطولة تركيز subsaturating لتحقيق سرعة مزلق أنيبيب الأمثل لتحميل البضائع 3. أخيرا ، تضاف biotinylated فلوريسئين المسمى nanospheres والبضائع. Nanospheres نعلق على ميكروتثبول نتيجة اصطدام بين ميكروتثبول مزلق وnanospheres الانضمام إلى السطح.
ويمكن بسهولة تعديل البروتوكول لتحميل مجموعة متنوعة من البضائع مثل الحمض النووي biotinylated 4 ، 5 نقاط الكم أو طائفة واسعة من مضادات الأجسام المضادة عبر biotinylated 4-6.
Protocol
Discussion
مع تعديلات طفيفة ، وقد تم هذا البروتوكول يستخدم بنجاح من قبل مجموعة متنوعة من الجماعات لتجميع kinesin – أنيبيب المقايسات الحركية القائمة. ويمكن استبدال 10 ملم في DTT الحل النهائي مع حركية 0.5 ٪ β – المركابتويثانول. وينبغي أن الحلول القياسية (BRB80AF ، وKIN20 MT1000) أكثر من 2 ساعة قديمة …
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نحن مدينون بشدة لجوناثان هوارد ، الذي وضعت مجموعة بروتوكول الأساسية للمقايسة حركية مزلق التي تم تكييفها لاحقا من قبلنا. مع التقدير والإمتنان الدعم المالي من جبهة الخلاص الوطني منحة DMR0645023.
Materials
| Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Adenosine-5’-triphosphate (ATP) | Invitrogen | A1049 | ||
| Biotin tubulin | Cytoskeleton Inc. | T333 | ||
| Casein | Sigma-Aldrich | C-0376 | ||
| Catalase | Sigma-Aldrich | C-9322 | ||
| D-(+)-Glucose | Sigma-Aldrich | G-7528 | ||
| Dimethylsulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D-8779 | ||
| Dithiotreitol (DTT) | Bio-Rad | 161-0610 | ||
| Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N′,N′-tetraacetic acid (EGTA) | Sigma-Aldrich | E-4378 | ||
| FluoSpheres Biotinylated microspheres, 40 nm, yellow-green fluorescent (505/515) | Invitrogen | F-8766 | ||
| Glucose oxidase | Sigma-Aldrich | G-7016 | ||
| Guanosine-5’-triphosphate (GTP) | Roche Diagnostic | 106399 | ||
| Magnesium Chloride (MgCl2) | Sigma-Aldrich | 63069 | ||
| Paclitaxel (Taxol) | Sigma-Aldrich | T1912 | ||
| 1,4-Piperazinediethanesulfonic acid, Piperazine-1,4-bis(2-ethanesulfonic acid), Piperazine-N,N′-bis(2-ethanesulfonic acid) (PIPES) | Sigma-Aldrich | P-6757 | ||
| Potassium hydroxide (KOH) | Sigma-Aldrich | P-6310 | ||
| Sodium hydroxide (NaOH) | Sigma-Aldrich | 480878 | ||
| Streptavidin Alexa Fluor 568 conjugate | Invitrogen | S11226 |
Referências
- Agarwal, A., Hess, H. Biomolecular motors at the intersection of nanotechnology and polymer science. Progress in Polymer Science. 35 (1-2), 252-252 (2010).
- Howard, J., Hunt, A. J., Baek, S. Assay of microtubule movement driven by single kinesin molecules. Methods Cell Biol. 39, 137-137 (1993).
- Agarwal, A., Katira, P., Hess, H. Millisecond curing time of a molecular adhesive causes velocity-dependent cargo-loading of molecular shuttles. Nano Lett. 9 (3), 1170-1170 (2009).
- Diez, S., Reuther, C., Dinu, C., Seidel, R., Mertig, M., Pompe, W., Howard, J. Stretching and Transporting DNA Molecules Using Motor Proteins. Nano Lett. 3 (9), 1251-1251 (2003).
- Bachand, G. D., Rivera, S. B., Boal, A. K., Gaudioso, J., Liu, J., Bunker, B. C. Assembly and transport of nanocrystal CdSe quantum dot nanocomposites using microtubules and kinesin motor proteins. Nano Lett. 4 (5), 817-817 (2004).
- Coy, D. L., Wagenbach, M., Howard, J. Kinesin takes one 8-nm step for each ATP that it hydrolyzes. J. Biol. Chem. 274 (6), 3667-3667 (1999).
- Katira, P., Agarwal, A., Fischer, T., Chen, H. -. Y., Jiang, X., Lahann, J., Hess, H. Quantifying the performance of protein-resisting surfaces at ultra-low protein coverages using kinesin motor proteins as probes. Advanced Materials. 19, 3171-3171 (2007).
- Vigers, G. P. A., Coue, M., McIntosh, J. R. Fluorescent Microtubules Break Up Under Illumination. J. Cell Biol. 107, 1011-1011 (1988).
- Brunner, C., Hess, H., Ernst, K. -. H., Vogel, V. Lifetime of biomolecules in hybrid nanodevices. Nanotechnology. 15 (10), S540-S540 (2004).
