המטען טוען על הסעות Kinesin מולקולרית מופעל
Summary
ההסעות מולקולרית המורכבת microtubules פונקציונליות מחליק על פני השטח, דבק kinesin חלבונים המנוע יכול לשמש כמערכת הובלה הננומטרי. הנה, הרכבה של מערכת הסעה טיפוסית מתואר.
Abstract
תאים התפתחו מכונות מולקולריות מתוחכמות, כגון חלבונים kinesin המנוע חוטים microtubule, לתמוך תחבורה תאיים פעיל של המטען. בעוד kinesins זנב תחום נקשר מגוון רחב של מטענים, kinesins תחומים הראש לנצל את האנרגיה הכימית מאוחסנים מולקולות ATP לשלב יחד הסריג microtubule. ארוך, microtubules נוקשה לשמש להובלת מסלולים למרחקים ארוכים תאיים.
מנועים אלה סיבים יכולים גם להיות מועסק בסביבות סינתטי microfabricated כרכיבים של המעבורות מולקולרית 1. בעיצוב נעשה שימוש תכוף, kinesin מנועים מעוגנים אל פני השטח את המסלול דרך הזנבות שלהם, microtubules פונקציונליות לשמש מרכיבים המטען שנשאו, אשר מונע על ידי מנועים אלה. בהסעות אלה ניתן לטעון עם מטען על ידי ניצול מחייב חזק סלקטיבית בין ביוטין ו streptavidin. מרכיבי מפתח (טובולין biotinylated, streptavidin, ומטענים biotinylated) זמינים מסחרית.
בונים על assay תנועתיות הקלאסי הפוכה 2, בנייה של המעבורות מולקולרי מפורט כאן. Kinesin חלבוני מנוע הם adsorbed על משטח precoated עם קזאין; microtubules הם polymerized של טובולין biotinylated, דבק kinesin ומצופה לאחר מכן עם streptavidin-rhodamine שכותרתו. ריכוז ה-ATP נשמר ריכוז subsaturating להשיג מהירות microtubule גלישה אופטימלית עבור טעינת מטען 3. לבסוף, biotinylated והעמסת שכותרתו nanospheres מתווספים כמו מטען. Nanospheres לצרף microtubules כתוצאה מהתנגשויות בין microtubules גלישה ו nanospheres שמירה על פני השטח.
הפרוטוקול ניתן לשנות בקלות לטעון מגוון רחב של מטענים כגון DNA biotinylated 4, 5 נקודות קוונטיות או מגוון רחב של אנטיגנים באמצעות נוגדנים biotinylated 4-6.
Protocol
Discussion
עם שינויים קלים, פרוטוקול זה שימש בהצלחה על ידי מגוון של קבוצות להרכיב kinesin-microtubule מבחני תנועתיות מבוסס. DTT 10 מ"מ הפתרון הסופי תנועתיות יכול להיות מוחלף עם 0.5% β-mercaptoethanol. תקן פתרונות (BRB80AF, KIN20 ו MT1000) יותר מ 2 שעות הישן לא צריך להשתמש. כל פתרון המכיל microtubules טקסול ובמיוחד ל…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנחנו אסירי תודה בכבדות אל יונתן הווארד, אשר פיתח את הקבוצה פרוטוקול בסיסי assay תנועתיות גלישה אשר הותאמה לאחר מכן על ידי בנו. תמיכה כספית מן NSF מענק DMR0645023 היא הודתה בהכרת תודה.
Materials
| Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Adenosine-5’-triphosphate (ATP) | Invitrogen | A1049 | ||
| Biotin tubulin | Cytoskeleton Inc. | T333 | ||
| Casein | Sigma-Aldrich | C-0376 | ||
| Catalase | Sigma-Aldrich | C-9322 | ||
| D-(+)-Glucose | Sigma-Aldrich | G-7528 | ||
| Dimethylsulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D-8779 | ||
| Dithiotreitol (DTT) | Bio-Rad | 161-0610 | ||
| Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N′,N′-tetraacetic acid (EGTA) | Sigma-Aldrich | E-4378 | ||
| FluoSpheres Biotinylated microspheres, 40 nm, yellow-green fluorescent (505/515) | Invitrogen | F-8766 | ||
| Glucose oxidase | Sigma-Aldrich | G-7016 | ||
| Guanosine-5’-triphosphate (GTP) | Roche Diagnostic | 106399 | ||
| Magnesium Chloride (MgCl2) | Sigma-Aldrich | 63069 | ||
| Paclitaxel (Taxol) | Sigma-Aldrich | T1912 | ||
| 1,4-Piperazinediethanesulfonic acid, Piperazine-1,4-bis(2-ethanesulfonic acid), Piperazine-N,N′-bis(2-ethanesulfonic acid) (PIPES) | Sigma-Aldrich | P-6757 | ||
| Potassium hydroxide (KOH) | Sigma-Aldrich | P-6310 | ||
| Sodium hydroxide (NaOH) | Sigma-Aldrich | 480878 | ||
| Streptavidin Alexa Fluor 568 conjugate | Invitrogen | S11226 |
Referências
- Agarwal, A., Hess, H. Biomolecular motors at the intersection of nanotechnology and polymer science. Progress in Polymer Science. 35 (1-2), 252-252 (2010).
- Howard, J., Hunt, A. J., Baek, S. Assay of microtubule movement driven by single kinesin molecules. Methods Cell Biol. 39, 137-137 (1993).
- Agarwal, A., Katira, P., Hess, H. Millisecond curing time of a molecular adhesive causes velocity-dependent cargo-loading of molecular shuttles. Nano Lett. 9 (3), 1170-1170 (2009).
- Diez, S., Reuther, C., Dinu, C., Seidel, R., Mertig, M., Pompe, W., Howard, J. Stretching and Transporting DNA Molecules Using Motor Proteins. Nano Lett. 3 (9), 1251-1251 (2003).
- Bachand, G. D., Rivera, S. B., Boal, A. K., Gaudioso, J., Liu, J., Bunker, B. C. Assembly and transport of nanocrystal CdSe quantum dot nanocomposites using microtubules and kinesin motor proteins. Nano Lett. 4 (5), 817-817 (2004).
- Coy, D. L., Wagenbach, M., Howard, J. Kinesin takes one 8-nm step for each ATP that it hydrolyzes. J. Biol. Chem. 274 (6), 3667-3667 (1999).
- Katira, P., Agarwal, A., Fischer, T., Chen, H. -. Y., Jiang, X., Lahann, J., Hess, H. Quantifying the performance of protein-resisting surfaces at ultra-low protein coverages using kinesin motor proteins as probes. Advanced Materials. 19, 3171-3171 (2007).
- Vigers, G. P. A., Coue, M., McIntosh, J. R. Fluorescent Microtubules Break Up Under Illumination. J. Cell Biol. 107, 1011-1011 (1988).
- Brunner, C., Hess, H., Ernst, K. -. H., Vogel, V. Lifetime of biomolecules in hybrid nanodevices. Nanotechnology. 15 (10), S540-S540 (2004).
