キネシンパワード分子シャトルバスへのロード貨物
Summary
に滑走の官能微小管から成る分子シャトルの表面に付着キネシンモータータンパク質は、ナノスケールの交通システムとして機能することができます。ここで、典型的なシャトルのシステムのアセンブリが記述されています。
Abstract
細胞は、貨物のアクティブな細胞内輸送をサポートするために、そのようなキネシンモーター蛋白質と微小管のフィラメントとして、洗練された分子機構を進化させてきた。キネシンのテールドメインは、貨物の多様に結合する一方、キネシン頭部ドメインは微小管の格子に沿って進むためにATP分子に保存されている化学エネルギーを利用する。長く、硬い微小管は、長距離細胞内輸送のためのトラックとして機能します。
これらのモータとフィラメントはまた、分子シャトル1の構成要素として、微細加工、合成環境で使用することができる。頻繁に使用する設計では、キネシンモーターはその尾を介して路面に固定されています、そして、官能微小管は、これらのモーターによって推進されている要素を、運ぶ貨物として役立つ。これらのシャトルは、ビオチンとストレプトアビジンとの間の強力かつ選択的結合を利用して貨物をロードすることができます。主要コンポーネントは、（ビオチン化チューブリン、ストレプトアビジン、およびビオチン化貨物）市販されている。
古典的な反転運動性アッセイ2で構築し、分子シャトルの建設は、ここで詳しく説明されています。キネシンモーター蛋白質はカゼインでプレコート表面に吸着され、微小管は、ビオチン化チューブリンから重合したキネシンに付着し、その後、ローダミン標識ストレプトアビジンでコーティングされています。 ATP濃度は、貨物3をロードするための最適な微小管の滑走速度を達成するためにsubsaturatingの濃度で維持されます。最後に、ビオチン化フルオレセイン標識ナノスフェアは、貨物として追加されます。ナノスフェアは、表面に付着したグライダーの微小管とナノ粒子間の衝突の結果として微小管に接続します。
プロトコルは、容易にこのようなビオチン化DNA 4、量子ドット5またはビオチン化抗体を4から6を介して抗原の多種多彩な貨物の様々なを読み込むように変更することができます。
Protocol
Discussion
マイナーな変更を加えることにより、このプロトコルが正常にキネシン微小管ベースの運動性アッセイを組み立てるためのグループの様々で使用されています。最終的な運動性の溶液中で10mMのDTT、0.5％β-メルカプトエタノールに置き換えることができます。 2時間以上古い標準溶液は（BRB80AF、KIN20とMT1000）に使用しないでください。特にタキソールと微小管を含む任意の溶液を氷の上に配置?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
我々は、そのグループその後、当社が適応された滑走運動アッセイのための基本的なプロトコルを開発したジョナサンハワード、に重債務です。 NSFの助成DMR0645023からの財政支援を感謝する。
Materials
| Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Adenosine-5’-triphosphate (ATP) | Invitrogen | A1049 | ||
| Biotin tubulin | Cytoskeleton Inc. | T333 | ||
| Casein | Sigma-Aldrich | C-0376 | ||
| Catalase | Sigma-Aldrich | C-9322 | ||
| D-(+)-Glucose | Sigma-Aldrich | G-7528 | ||
| Dimethylsulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D-8779 | ||
| Dithiotreitol (DTT) | Bio-Rad | 161-0610 | ||
| Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N′,N′-tetraacetic acid (EGTA) | Sigma-Aldrich | E-4378 | ||
| FluoSpheres Biotinylated microspheres, 40 nm, yellow-green fluorescent (505/515) | Invitrogen | F-8766 | ||
| Glucose oxidase | Sigma-Aldrich | G-7016 | ||
| Guanosine-5’-triphosphate (GTP) | Roche Diagnostic | 106399 | ||
| Magnesium Chloride (MgCl2) | Sigma-Aldrich | 63069 | ||
| Paclitaxel (Taxol) | Sigma-Aldrich | T1912 | ||
| 1,4-Piperazinediethanesulfonic acid, Piperazine-1,4-bis(2-ethanesulfonic acid), Piperazine-N,N′-bis(2-ethanesulfonic acid) (PIPES) | Sigma-Aldrich | P-6757 | ||
| Potassium hydroxide (KOH) | Sigma-Aldrich | P-6310 | ||
| Sodium hydroxide (NaOH) | Sigma-Aldrich | 480878 | ||
| Streptavidin Alexa Fluor 568 conjugate | Invitrogen | S11226 |
Referências
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