Fonksiyonlu mikrotübül üzerinde kayma yüzeyi yapıştırılır kinesin motorlu proteinlerinin nano ölçekli bir taşıma sistemi olarak hizmet verebilir oluşan Moleküler mekik. Burada, tipik bir servis sistemi montaj açıklanmıştır.
Hücreler kinesin motor proteinlerin ve mikrotübül filamentler gibi aktif hücre içi kargo taşımacılığı desteklemek için, gelişmiş moleküler makineler gelişmiştir. Kinesins kuyruk etki alanı yüklerin çeşitli bağlar iken, kinesins baş etki alanı mikrotübül kafes boyunca adım ATP molekülleri depolanan kimyasal enerjiyi kullanır. Uzun, sert mikrotübül, uzun mesafe hücre içi ulaşım için parça olarak hizmet vermektedir.
Bu motorlar ve filamentler, aynı zamanda moleküler mekik 1 bileşenleri olarak microfabricated sentetik ortamlarda istihdam edilebilir. Sık kullanılan bir tasarım, kinesin motorlar kendi kuyrukları ile parça yüzey demirlemiş ve Fonksiyonlu mikrotübüllerin bu motorlar ile hareketli yük taşıyan unsurları, olarak hizmet vermektedir. Bu mekik, biotin ve streptavidin arasında güçlü ve seçici bir bağlayıcılığı kullanan kargo ile yüklenebilir. Anahtar bileşenleri (biotinlenmiş tubulin, streptavidin ve biotinlenmiş kargo) ticari olarak kullanılabilir.
Klasik ters motilite tayini 2 Bina, inşaat moleküler mekiklerinin burada ayrıntılı. Kinesin Motor proteinleri kazein ile kaplanmış bir yüzeye adsorbe; mikrotübül, biotinlenmiş tubulin polimerize kinesin yapıştırılır ve daha sonra rodamin etiketli streptavidin ile kaplı. ATP konsantrasyonu kargo 3 yükleme için optimum bir mikrotübül kayma hızı elde etmek için subsaturating konsantrasyon tutulur. Son olarak, biotinlenmiş floresein etiketli nanokürecikler kargo olarak eklenir. Nanokürecikler kayma yüzeyine yapışan mikrotübül ve nanokürecikler arasındaki çarpışmalar sonucu olarak mikrotübül eklemek.
Protokol biotinlenmiş DNA 4, kuantum noktaları 5 veya biotinlenmiş antikorlar 4-6 aracılığıyla antijenleri geniş bir yelpazede çeşitli yüklerin kolayca yüklemek için modifiye edilebilir.
Küçük değişiklikler ile bu protokolü kinesin-mikrotübül tabanlı motilite testleri başarıyla monte etmek için çeşitli gruplar tarafından kullanılan olmuştur. Son motilite çözüm 10 mM DTT,% 0.5 'β-mercaptoethanol ile değiştirilebilir. 2 saatten fazla standart çözümler (BRB80AF KIN20 ve MT1000) olmamalıdır. Taksol ve özellikle mikrotübül içeren herhangi bir çözüm, buz üzerinde atÛlmamalÛdÛr. Işlevsel bileşenleri fotohasar UV uyarma ışık akışını hücrenin aşırı maruz ka…
The authors have nothing to disclose.
Biz yoğun olan grup, daha sonra bize adapte oldu bir kayma motilite tayini için temel protokolü geliştirildi Jonathon Howard, borçlu. NSF hibe DMR0645023 mali destek minnetle kabul edilmektedir.
Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
---|---|---|---|---|
Adenosine-5’-triphosphate (ATP) | Invitrogen | A1049 | ||
Biotin tubulin | Cytoskeleton Inc. | T333 | ||
Casein | Sigma-Aldrich | C-0376 | ||
Catalase | Sigma-Aldrich | C-9322 | ||
D-(+)-Glucose | Sigma-Aldrich | G-7528 | ||
Dimethylsulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D-8779 | ||
Dithiotreitol (DTT) | Bio-Rad | 161-0610 | ||
Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N′,N′-tetraacetic acid (EGTA) | Sigma-Aldrich | E-4378 | ||
FluoSpheres Biotinylated microspheres, 40 nm, yellow-green fluorescent (505/515) | Invitrogen | F-8766 | ||
Glucose oxidase | Sigma-Aldrich | G-7016 | ||
Guanosine-5’-triphosphate (GTP) | Roche Diagnostic | 106399 | ||
Magnesium Chloride (MgCl2) | Sigma-Aldrich | 63069 | ||
Paclitaxel (Taxol) | Sigma-Aldrich | T1912 | ||
1,4-Piperazinediethanesulfonic acid, Piperazine-1,4-bis(2-ethanesulfonic acid), Piperazine-N,N′-bis(2-ethanesulfonic acid) (PIPES) | Sigma-Aldrich | P-6757 | ||
Potassium hydroxide (KOH) | Sigma-Aldrich | P-6310 | ||
Sodium hydroxide (NaOH) | Sigma-Aldrich | 480878 | ||
Streptavidin Alexa Fluor 568 conjugate | Invitrogen | S11226 |