Kinesin Powered Moleküler minibüsleri üzerine Kargo Yükleniyor
Summary
Fonksiyonlu mikrotübül üzerinde kayma yüzeyi yapıştırılır kinesin motorlu proteinlerinin nano ölçekli bir taşıma sistemi olarak hizmet verebilir oluşan Moleküler mekik. Burada, tipik bir servis sistemi montaj açıklanmıştır.
Abstract
Hücreler kinesin motor proteinlerin ve mikrotübül filamentler gibi aktif hücre içi kargo taşımacılığı desteklemek için, gelişmiş moleküler makineler gelişmiştir. Kinesins kuyruk etki alanı yüklerin çeşitli bağlar iken, kinesins baş etki alanı mikrotübül kafes boyunca adım ATP molekülleri depolanan kimyasal enerjiyi kullanır. Uzun, sert mikrotübül, uzun mesafe hücre içi ulaşım için parça olarak hizmet vermektedir.
Bu motorlar ve filamentler, aynı zamanda moleküler mekik 1 bileşenleri olarak microfabricated sentetik ortamlarda istihdam edilebilir. Sık kullanılan bir tasarım, kinesin motorlar kendi kuyrukları ile parça yüzey demirlemiş ve Fonksiyonlu mikrotübüllerin bu motorlar ile hareketli yük taşıyan unsurları, olarak hizmet vermektedir. Bu mekik, biotin ve streptavidin arasında güçlü ve seçici bir bağlayıcılığı kullanan kargo ile yüklenebilir. Anahtar bileşenleri (biotinlenmiş tubulin, streptavidin ve biotinlenmiş kargo) ticari olarak kullanılabilir.
Klasik ters motilite tayini 2 Bina, inşaat moleküler mekiklerinin burada ayrıntılı. Kinesin Motor proteinleri kazein ile kaplanmış bir yüzeye adsorbe; mikrotübül, biotinlenmiş tubulin polimerize kinesin yapıştırılır ve daha sonra rodamin etiketli streptavidin ile kaplı. ATP konsantrasyonu kargo 3 yükleme için optimum bir mikrotübül kayma hızı elde etmek için subsaturating konsantrasyon tutulur. Son olarak, biotinlenmiş floresein etiketli nanokürecikler kargo olarak eklenir. Nanokürecikler kayma yüzeyine yapışan mikrotübül ve nanokürecikler arasındaki çarpışmalar sonucu olarak mikrotübül eklemek.
Protokol biotinlenmiş DNA 4, kuantum noktaları 5 veya biotinlenmiş antikorlar 4-6 aracılığıyla antijenleri geniş bir yelpazede çeşitli yüklerin kolayca yüklemek için modifiye edilebilir.
Protocol
Discussion
Küçük değişiklikler ile bu protokolü kinesin-mikrotübül tabanlı motilite testleri başarıyla monte etmek için çeşitli gruplar tarafından kullanılan olmuştur. Son motilite çözüm 10 mM DTT,% 0.5 'β-mercaptoethanol ile değiştirilebilir. 2 saatten fazla standart çözümler (BRB80AF KIN20 ve MT1000) olmamalıdır. Taksol ve özellikle mikrotübül içeren herhangi bir çözüm, buz üzerinde atÛlmamalÛdÛr. Işlevsel bileşenleri fotohasar UV uyarma ışık akışını hücrenin aşırı maruz ka…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Biz yoğun olan grup, daha sonra bize adapte oldu bir kayma motilite tayini için temel protokolü geliştirildi Jonathon Howard, borçlu. NSF hibe DMR0645023 mali destek minnetle kabul edilmektedir.
Materials
| Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Adenosine-5’-triphosphate (ATP) | Invitrogen | A1049 | ||
| Biotin tubulin | Cytoskeleton Inc. | T333 | ||
| Casein | Sigma-Aldrich | C-0376 | ||
| Catalase | Sigma-Aldrich | C-9322 | ||
| D-(+)-Glucose | Sigma-Aldrich | G-7528 | ||
| Dimethylsulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D-8779 | ||
| Dithiotreitol (DTT) | Bio-Rad | 161-0610 | ||
| Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N′,N′-tetraacetic acid (EGTA) | Sigma-Aldrich | E-4378 | ||
| FluoSpheres Biotinylated microspheres, 40 nm, yellow-green fluorescent (505/515) | Invitrogen | F-8766 | ||
| Glucose oxidase | Sigma-Aldrich | G-7016 | ||
| Guanosine-5’-triphosphate (GTP) | Roche Diagnostic | 106399 | ||
| Magnesium Chloride (MgCl2) | Sigma-Aldrich | 63069 | ||
| Paclitaxel (Taxol) | Sigma-Aldrich | T1912 | ||
| 1,4-Piperazinediethanesulfonic acid, Piperazine-1,4-bis(2-ethanesulfonic acid), Piperazine-N,N′-bis(2-ethanesulfonic acid) (PIPES) | Sigma-Aldrich | P-6757 | ||
| Potassium hydroxide (KOH) | Sigma-Aldrich | P-6310 | ||
| Sodium hydroxide (NaOH) | Sigma-Aldrich | 480878 | ||
| Streptavidin Alexa Fluor 568 conjugate | Invitrogen | S11226 |
Referências
- Agarwal, A., Hess, H. Biomolecular motors at the intersection of nanotechnology and polymer science. Progress in Polymer Science. 35 (1-2), 252-252 (2010).
- Howard, J., Hunt, A. J., Baek, S. Assay of microtubule movement driven by single kinesin molecules. Methods Cell Biol. 39, 137-137 (1993).
- Agarwal, A., Katira, P., Hess, H. Millisecond curing time of a molecular adhesive causes velocity-dependent cargo-loading of molecular shuttles. Nano Lett. 9 (3), 1170-1170 (2009).
- Diez, S., Reuther, C., Dinu, C., Seidel, R., Mertig, M., Pompe, W., Howard, J. Stretching and Transporting DNA Molecules Using Motor Proteins. Nano Lett. 3 (9), 1251-1251 (2003).
- Bachand, G. D., Rivera, S. B., Boal, A. K., Gaudioso, J., Liu, J., Bunker, B. C. Assembly and transport of nanocrystal CdSe quantum dot nanocomposites using microtubules and kinesin motor proteins. Nano Lett. 4 (5), 817-817 (2004).
- Coy, D. L., Wagenbach, M., Howard, J. Kinesin takes one 8-nm step for each ATP that it hydrolyzes. J. Biol. Chem. 274 (6), 3667-3667 (1999).
- Katira, P., Agarwal, A., Fischer, T., Chen, H. -. Y., Jiang, X., Lahann, J., Hess, H. Quantifying the performance of protein-resisting surfaces at ultra-low protein coverages using kinesin motor proteins as probes. Advanced Materials. 19, 3171-3171 (2007).
- Vigers, G. P. A., Coue, M., McIntosh, J. R. Fluorescent Microtubules Break Up Under Illumination. J. Cell Biol. 107, 1011-1011 (1988).
- Brunner, C., Hess, H., Ernst, K. -. H., Vogel, V. Lifetime of biomolecules in hybrid nanodevices. Nanotechnology. 15 (10), S540-S540 (2004).
