Lastning på Kinesin Powered Molekylär Shuttles
Summary
Molekylär skyttlar bestående av functionalized mikrotubuli glida på ytan, följt kinesin motorproteiner kan fungera som en nanoskala transportsystem. Här är den församling av en typisk transfer system som beskrivs.
Abstract
Celler har utvecklats sofistikerade molekylära maskiner, t.ex. kinesin motorproteiner och filament mikrotubuli, för att stödja aktiva intracellulära transport av gods. Medan kinesins svans domän binder till olika laster, kinesins huvudet domäner utnyttja kemisk energi som lagras i ATP-molekyler till steg längs mikrotubuli gitter. Den långa, styva mikrotubuli fungera som spår för långväga intracellulära transporter.
Dessa motorer och trådar kan också vara anställd i mikrofabricerade syntetiska miljöer som komponenter av molekylära pendlar 1. I en ofta använd konstruktion, kinesin motorer förankras i körbanan genom sina svansar, och functionalized mikrotubuli fungera som last transporterar element, som drivs av dessa motorer. Dessa skyttlar kan laddas med last genom att utnyttja de starka och selektiv bindning mellan biotin och streptavidin. De viktigaste komponenterna (biotinylerad tubulin, streptavidin och biotinylerad gods) finns kommersiellt tillgängliga.
Bygger på den klassiska inverterade motilitet analys 2, är byggandet av molekylära pendlar närmare här. Kinesin motorproteiner är adsorberade på en yta precoated med kasein, mikrotubuli polymeriserat från biotinylerad tubulin, anslutit sig till kinesin och därefter belagd med Rhodamine märkt streptavidin. ATP-koncentrationen hålls på subsaturating koncentration för att uppnå en mikrotubuli segelflygning hastighet optimalt för lastning 3. Slutligen biotinylerad fluorescein-märkta nanospheres läggs till som last. Nanospheres fäster mikrotubuli som en följd av kollisioner mellan glid mikrotubuli och nanospheres fastnat på ytan.
Protokollet kan lätt ändras för att ladda en mängd olika laster som biotinylerad DNA-4, kvantprickar 5 eller en mängd olika antigener via biotinylerad antikroppar 4-6.
Protocol
Discussion
Med smärre modifieringar har detta protokoll använts framgångsrikt av olika grupper att montera kinesin-mikrotubuli baserade motilitet analyser. 10 mM DTT i den slutliga motilitet lösningen kan ersättas med 0,5% β-merkaptoetanol. Standardlösningar (BRB80AF, KIN20 och MT1000) mer än 2 timmar gammal bör inte användas. Varje lösning innehållande Taxol och särskilt mikrotubuli får aldrig placeras på is. Överdriven exponering av flödescellen för UV-resultat excitation ljus i fotoskador till den funktionella…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi är kraftigt skuldsatt Jonathon Howard, vars grupp utvecklat den grundläggande protokollet för en segelflygning motilitet test som sedan anpassats av oss. Ekonomiskt stöd från NSF bevilja DMR0645023 är tacksamt erkänns.
Materials
| Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Adenosine-5’-triphosphate (ATP) | Invitrogen | A1049 | ||
| Biotin tubulin | Cytoskeleton Inc. | T333 | ||
| Casein | Sigma-Aldrich | C-0376 | ||
| Catalase | Sigma-Aldrich | C-9322 | ||
| D-(+)-Glucose | Sigma-Aldrich | G-7528 | ||
| Dimethylsulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D-8779 | ||
| Dithiotreitol (DTT) | Bio-Rad | 161-0610 | ||
| Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N′,N′-tetraacetic acid (EGTA) | Sigma-Aldrich | E-4378 | ||
| FluoSpheres Biotinylated microspheres, 40 nm, yellow-green fluorescent (505/515) | Invitrogen | F-8766 | ||
| Glucose oxidase | Sigma-Aldrich | G-7016 | ||
| Guanosine-5’-triphosphate (GTP) | Roche Diagnostic | 106399 | ||
| Magnesium Chloride (MgCl2) | Sigma-Aldrich | 63069 | ||
| Paclitaxel (Taxol) | Sigma-Aldrich | T1912 | ||
| 1,4-Piperazinediethanesulfonic acid, Piperazine-1,4-bis(2-ethanesulfonic acid), Piperazine-N,N′-bis(2-ethanesulfonic acid) (PIPES) | Sigma-Aldrich | P-6757 | ||
| Potassium hydroxide (KOH) | Sigma-Aldrich | P-6310 | ||
| Sodium hydroxide (NaOH) | Sigma-Aldrich | 480878 | ||
| Streptavidin Alexa Fluor 568 conjugate | Invitrogen | S11226 |
Referências
- Agarwal, A., Hess, H. Biomolecular motors at the intersection of nanotechnology and polymer science. Progress in Polymer Science. 35 (1-2), 252-252 (2010).
- Howard, J., Hunt, A. J., Baek, S. Assay of microtubule movement driven by single kinesin molecules. Methods Cell Biol. 39, 137-137 (1993).
- Agarwal, A., Katira, P., Hess, H. Millisecond curing time of a molecular adhesive causes velocity-dependent cargo-loading of molecular shuttles. Nano Lett. 9 (3), 1170-1170 (2009).
- Diez, S., Reuther, C., Dinu, C., Seidel, R., Mertig, M., Pompe, W., Howard, J. Stretching and Transporting DNA Molecules Using Motor Proteins. Nano Lett. 3 (9), 1251-1251 (2003).
- Bachand, G. D., Rivera, S. B., Boal, A. K., Gaudioso, J., Liu, J., Bunker, B. C. Assembly and transport of nanocrystal CdSe quantum dot nanocomposites using microtubules and kinesin motor proteins. Nano Lett. 4 (5), 817-817 (2004).
- Coy, D. L., Wagenbach, M., Howard, J. Kinesin takes one 8-nm step for each ATP that it hydrolyzes. J. Biol. Chem. 274 (6), 3667-3667 (1999).
- Katira, P., Agarwal, A., Fischer, T., Chen, H. -. Y., Jiang, X., Lahann, J., Hess, H. Quantifying the performance of protein-resisting surfaces at ultra-low protein coverages using kinesin motor proteins as probes. Advanced Materials. 19, 3171-3171 (2007).
- Vigers, G. P. A., Coue, M., McIntosh, J. R. Fluorescent Microtubules Break Up Under Illumination. J. Cell Biol. 107, 1011-1011 (1988).
- Brunner, C., Hess, H., Ernst, K. -. H., Vogel, V. Lifetime of biomolecules in hybrid nanodevices. Nanotechnology. 15 (10), S540-S540 (2004).
