Este protocolo é um trecho de Sunderhaus e Kretzschmar, Histologia de massa para quantificar a neurodegeneração em Drosophila, J. Vis. Exp. (2016).
1. Fixação da cabeça em colares e incorporação em parafina
NOTA: Todas as etapas do processo de fixação devem ser realizadas em uma hotte. O metilbenzoato, embora não represente um risco para a saúde, tem um odor altamente distinto, que pode ser avassalador se não for manuseado em uma capela de exaustão.
- Antes de anestesiar as moscas, faça 50 mL de solução de Carnoy adicionando 15 mL de clorofórmio e 5 mL de ácido acético glacial a 30 mL de etanol a 99% (não misture o clorofórmio e o ácido acético). Despeje em um recipiente de vidro com fundo plano, como um prato de cristalização, para garantir que os colares possam ficar planos e completamente cobertos pela solução.
- Anestesie as moscas com CO2 ou éter.
- A linha voa (até 20 com a maioria dos colares) pelo pescoço para dentro dos colares usando uma pinça. Lembre-se de alinhar todas as cabeças na mesma orientação, como visto em Figura 1A, e seja gentil para garantir que nenhum dano ocorra na cabeça ou nos olhos.
- Incluir moscas sine oculis (setas, Figura 1A) em posições aleatórias para que a ordem das moscas possa ser facilmente identificada nas secções. Além disso, se as moscas experimentais tiverem olhos claros ou brancos, enfie algumas moscas de olhos vermelhos, como o tipo selvagem, entre elas para garantir que haja pigmento suficiente para manchar a lâmina. Registre a ordem das moscas em uma folha de protocolo junto com o número do colarinho, se estiver usando mais de um colar.
- Depois que um colar estiver pronto, coloque-o na solução Carnoy preparada por 3,5 - 4 h.
- Despeje a solução de Carnoy no recipiente de descarte apropriado e comece as lavagens com etanol. Certifique-se de despejar lentamente para não atrapalhar a colocação dos colares no recipiente.
- Lave as coleiras por 30 min em etanol a 99% duas vezes.
- Lave as coleiras em etanol 100% por 1 h. Certifique-se de trocar as lavagens a tempo para evitar a desidratação excessiva.
- Colocar os colares em metilbenzoato O/N à RT. Selar o recipiente com parafilme para evitar a evaporação do metilbenzoato.
- Despeje o metilbenozato no recipiente descartável adequado na hotte. Adicione uma mistura previamente preparada de cera de parafina 1:1 de baixo ponto de fusão (56 - 57 °C) e metilbenzoato. A partir deste ponto, os colares precisam ser mantidos em uma incubadora a 65 °C para garantir que a parafina não endureça.
- Despeje a mistura de metilbenozato e parafina no recipiente descartável adequado e despeje a cera de parafina pura derretida, mantida a 65 ° C, nos colares.
- Troque a parafina após 30 minutos e repita pelo menos 5 vezes. Pelo menos 6 a 8 lavagens devem ser realizadas.
- Quando as lavagens estiverem concluídas, coloque os colares em uma bandeja de cubos de gelo de borracha com ranhuras aproximadamente do tamanho dos colarinhos. Despeje parafina derretida sobre eles até ficarem completamente cobertos e deixe endurecer O/N (tente evitar bolhas de ar).
- Remova os blocos de parafina que contêm os colares da bandeja de cubos de gelo. Separe o bloco de parafina do colar usando uma lâmina de barbear, quebrando suavemente o colar. As cabeças ficarão no bloco de parafina enquanto os corpos ficarão no colarinho. Os blocos podem ser mantidos em temperatura ambiente.
- Para limpar os colares, mergulhe-os em um agente de desparafinização a 65 °C para remover a parafina, limpe com uma leve esfrega e lave com etanol antes de reutilizar.
