Um passo-metabolômica: carboidratos, ácidos orgânicos e aminoácidos quantificados em um procedimento único

Summary

O método da urease de preparação de amostra para análise GC / MS de metabólitos intermediários é apresentado por seu inventor. O método permite uma etapa de acompanhamento da triagem neonatal para erros inatos por espectrometria de massa em tandem por carboidratos quantificar, orgânicos e aminoácidos tudo em um único processo.

Abstract

Cada criança nascida em os EUA estão agora selecionados para até 42 distúrbios genéticos raros chamado de "erros inatos do metabolismo". O método de rastreamento é baseado em espectrometria de massa e quantifica acilcarnitinas como uma tela de acidemias orgânicas e também medidas de aminoácidos. Todos os estados também realizam testes enzimáticos para distúrbios de carboidratos, como galactosemia. Porque os resultados podem ser não-específicos, testes de acompanhamento de resultados positivos é necessário usar um método mais definitivo. O presente relatório descreve o "urease" método de preparação de amostras para triagem de erros inatos. Enzima urease cristalino é usado para remover a uréia a partir de fluidos corporais que permite a maioria dos outros metabólitos solúveis em água para ser desidratado e derivatizado por cromatografia gasosa em um único procedimento. Desidratação por evaporação em um fluxo de nitrogênio é facilitada pela adição de acetonitrila e cloreto de metileno. Então, trimethylsilylation ocorre na presença de um único trifluoroacetato triethylammonium catalisador,. Injeção automatizada e cromatografia é seguido por macro-driven quantificação custom de 192 metabolitos e semi-quantificação de cada componente principal utilizando bibliotecas especializadas de espectros de massa de TMS derivatizado compostos biológicos. A análise pode ser realizada na plataforma ChemStation amplamente utilizado usando as macros e bibliotecas disponíveis do autor. Em nosso laboratório, mais de 16.000 amostras de pacientes foram analisados ​​usando o método com um rendimento diagnóstico de cerca de 17% – ou seja, 17% dos resultados de amostras revelam descobertas que devem ser postas em prática pelo médico de ordenação. Entre estes, estão confirmadas mais de 180 erros inatos, dos quais cerca de 38% não poderia ter sido diagnosticada por meio de métodos anteriores.

Protocol

Procedimento para Processamento de Amostras de Urina Descongelar a amostra de urina em um banho de água 37 ° C. Decantar em um recipiente novo se o original é comprometida. Dê uma alíquota máxima de 13 ml de amostra e armazená-lo a -20 ° C em um tubo de centrífuga cônico rotulados. Medir e registrar a densidade óptica da amostra, colocando algumas gotas de urina no refratômetro. Filtrar a amostra através de um filtro de 0,2 um. Meça o volume da amostra abaixo de acordo com a densidade óptica 1,000-1,009 1,00 ml 1,010-1,019 0,50 ml 1,020-1,050 0,25 ml + 0,25 ml H 2 O O volume especificado é então transferido para uma Reactivial contendo as seguintes normas internas: 500 nanomoles (nmoles) 3 Creatina, 10 nmoles d ácido 3 Methylmalonic, 100 nmoles cada um dos 13 seguintes lactato C 3, 13 C 3 piruvato, 13 C 2 15 N glicina, serina d 3, d 5 fenilalanina, d 11 hexanoylglycine, 15 N 2 orotate, d ácido 4 sebácico, 13 C 6 glicose, inositol e d 6 d 5 triptofano. 20 microlitros (L) de um 7,5 Unidades / mL de solução de urease (Calzyme catálogo Laboratories não. 116A0100) é adicionado à amostra, que é então lavada e selado sob CO 2 através de um septo inerte. A amostra é realizada a 37 ° C por 30 minutos com mais gás de dióxido de carbono acrescentado em intervalos de 15 minutos para manter a pressão. 20 l da solução mais urease é adicionado, o frasco é lavada com dióxido de carbono, sendo a amostra mantida a 37 ° C por mais 15 minutos. 500 mL de acetona 30:70: metanol é adicionado, o septo de borracha é substituído por um septo de teflon revestida, ea amostra é refrigerada a -20 ° C por 15 minutos. Sólidos são removidos por centrifugação a 1500 rpm x 10 minutos e decantado em um ambiente limpo 2,0 cc Reactivial (Supelco / Sigma) Adicionar trifluoroacetato triethylammonium (TEA / TFA) (Sigma) como segue: 20 l para 1,00 ml amostras 40 mL para 0,5 ml, ou menos, as amostras Blusa com acetonitrila e colocar sob um fluxo de nitrogênio a 70 ° C, até volume constante é alcançada (TEA / TFA permanecerá) (~ 15 minutos). Repita o passo 13, até 4 vezes até que se forme um precipitado (~ 10 minutos cada). Deixe esfriar por cerca de 2 minutos. Blusa com cloreto de metileno, tendo o cuidado de ferver, e seca (~ 4:00 minutos). Repita o passo 15. Adicionar MSTFA (N-metil-N-trimethylsilyltrifluoroacetamide) (Thermal Científica) às seguintes taxas: 150 mL para 1,00 ml amostras 200 mL para 0,50 ml, ou menos, as amostras Cap sob atmosfera de nitrogênio e incubar a 70 ° C por 1 hora. Transferência para microtubos, sob uma atmosfera de nitrogênio, para análise em cromatógrafo a gás espectrômetro / massa. Microtubos lugar para injeção automatizada pela Agilent 5975 GC / MS: Instrumento temperaturas são as seguintes: injetor 200 ° C, interface 250 ° C, forno 80 ° C por 1 minuto; rampa a 4 ° C / minuto 80-130 ° C rampa, em 6 ° C / minuto 130-200 ° C, rampa a 12 ° C / minuto 200-285 ° C, segure por 10 minutos. Coluna: 25 m, 320 micron ID, 0,5 micron de espessura de filme DB-5. Spec massa: fonte de 230 ° C, quad 150 ° C, Scan 50-650 amu em 2,46 scans / sec. Solvente demora 3,5 minutos. Resultados representante Por favor, clique aqui para ver os resultados representativos.

Discussion

O método urease (1) tem sido citado 62 vezes na literatura médica, com várias modificações. Grupo Matsumoto (2,3) simplificou o procedimento para high-throughput screening neonatal e relatou os resultados de 16.000 pacientes. Kuhara e outros (4-7) relataram o uso do método em vários casos de diagnóstico de erro inato e follow-up. Rhead (8) também confirmou a utilidade do método para o diagnóstico clínico e acompanhamento de erros inatos. O método tem sido aplicado a urina de ursos, camundongos knock-out, elefantes e homogeneizados de moscas da fruta inteira e suas larvas (9). Meios de cultura de Cryptococcus antes e depois do local dirigida mutagênese também foram analisados, sem a etapa urease (10). O método foi aplicado para avaliação nutricional em estudantes de medicina humana, de Down e pacientes com síndrome demencial veteranos idosos depois de carregar os indivíduos com doses orais dos aminoácidos triptofano, metionina e isoleucina (11). Todos os oito vitaminas B foram avaliados pela quantificação do produtos de degradação dos três aminoácidos que, entre eles, exigir que todas as oito vitaminas em algum momento de sua degradação. Os efeitos tóxicos de produtos farmacêuticos e sua mitigação pela suplementação de vitamina tem sido relatada (12). Amostras de líquido amniótico de gestações normais e síndrome de Down foram analisados ​​e relatados (13-15).

Materials

Material Name	Tipo	Company	Catalogue Number	Comment
MSD 5975		Agilent		GC/MS/Computer
MSD 5973		Agilent		GC/MS/Computer
Urease		Calzyme	116A0100	Also Sigma C3
Stable Isotope Standards		CDN Isotopes, Isotec, Cambridge Isotope Lab
Solvents		Fisher
Analytes		Sigma, Universidad Autonoma de Madrid, Ernesto Brunet
GC Columns		J&W Scientific	123-5026
TEA/TFA		Fluka/Sigma	09747
Vials		Supelco/Sigma	Z115088/12EA
Merlin Microseal		Agilent	5181-8815
MSTFA		Thermal Scientific	48913