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Artigo de método
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30 de abril de 2023
Fonte: Imura, E., et al. Protocolos para visualização de órgãos esteroidogênicos e seus órgãos interativos com imunocoloração na mosca-da-fruta Drosophila melanogaster. J. Vis. Exp. (2017).
Este vídeo descreve a glândula anelar de Drosophila, uma estrutura endócrina complexa importante para a biossíntese e secreção de ecdisteróides e outros hormônios. O protocolo apresentado demonstra sua dissecção, fixação e imunocoloração.
Este protocolo é um trecho de Imura et al., Protocolos para visualização de órgãos esteroidogênicos e seus órgãos interativos com imunocoloração na mosca da fruta Drosophila melanogaster, J. Vis. Exp. (2017).
NOTA: O esquema geral dos protocolos é mostrado em Figura 1.
1. A Dissecção da Glândula Anelar Larval (RG)
NOTA: Em D. melanogaster, que pertence aos dípteros ciclorráfalos, o PG está dentro de um órgão endócrino composto chamado glândula anelar (RG,
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Figura 1: O esquema geral dos protocolos. Dois métodos distintos de dissecação são aplicáveis a larvas e fêmeas adultas, dependendo do objetivo dos experimentos. Os métodos de montagem também são concebidos de acordo com as condições da amostra. As técnicas de fixação, coloração e imagem são basicamente comuns a todas as amostras. Cl.......
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| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Coleção de ovos | |||
| Placa de cultura de tecidos (55 mm) | COMO UM | Rolamento 1-8549-02 | para placas de ágar-ágar de suco de uva |
| copo de coleção | HIKARI KAGAKU | ||
| pasta de levedura | Levedura seca oriental, Tóquio | ||
| Suco de uva 100% | Welch Alimentos Inc. | ||
| larvas de criação | |||
| frascos pequenos (12 ml, 40×23,5 mm, PS) | SARSTEDT | 58.487 | |
| laço descartável | COMO UM | Nº 6-488-01 | |
| alimento padrão para moscas | A receita está no site do centro de estoque de Bloomington. | ||
| dissecção | |||
| microscópio de dissecação | Carl Zeiss | Stemi 2000-C | |
| microscópio de dissecação | Leica | S8 AP0 | |
| Placa de cultura de tecidos (35 x 10 mm, não tratada) | IWAKI | 1000-035 | |
| Silgard | TORAY | coarting silicone dentro dos pratos | |
| Agulha Terumo (27G, 0,40 x 19 mm) | TERUMO | NN-2719S | Uma "faca" para cortar o tecido |
| fórceps, Inox, #5 | Dumont, Suíça | ||
| alfinete de inseto (0,18 mm de diâmetro) | Marca Shiga | para dissecção de filetes | |
| micro tesoura | NATSUME SEISAKUSHO CO LTD. | MB-50-10 | |
| fixação | |||
| Água ultrapura | Merck Millipore | ||
| solução salina tamponada com fosfato (PBS) | |||
| Formaldeído | Tesque de Nacalai | Rolamento 16222-65 | |
| Paraformaldeído | Tesque de Nacalai | 02890-45 | |
| Tritão-X100 | Tesque de Nacalai | 35501-15 | |
| microtubos (1,5 ml) | INA OPTIKA | CF-0150 | |
| Incubação | |||
| Como um misturador de swist TM-300 (rocker) | Como um | TM-300 | roqueiro |
| Albumina de soro bovino | sigma | 9048-46-8 | |
| Anticorpo primário | |||
| anti-Sro (cobaia), 1:1000 | |||
| anti-GFP (coelho), 1:1000 | Sondas Moleculares | Rolamento A6455 | Shimada-Niwa ans Niwa, 2014 |
| anti-GFP (mAb de camundongo, GF200), 1:100 | Nakarai tesque | 04363-66 | |
| anti-5HT (coelho), 1:500 | sigma | S5545 | |
| anti-Hts 1B1 (mouse) | Banco de Hibridoma de Estudos de Desenvolvimento (DSHB) | 1B1 | |
| anti-DE-caderina (rato), 1:20 | DSHB | DCAD2 | |
| Anti-NC82 (mouse), 1:50 | DSHB | Próximo a 82 | |
| Anticorpo secundário | |||
| Anticorpo secundário anti-Rabbit IgG (H + L) de cabra, conjugado Alexa Fluor 488 | Tecnologias da Vida | A-11008 | |
| Anticorpo secundário anti-camundongo IgG (H + L) de cabra, conjugado Alexa Fluor 488 | Tecnologias da Vida | A-11001 | |
| Anticorpo secundário anti-rato IgG (H + L) de cabra, conjugado Alexa Fluor 546 | Tecnologias da Vida | A-11081 | |
| Anticorpo secundário IgG (H+L) anticobaia de cabra, conjugado Alexa Fluor 555 | Tecnologias da Vida | A-21435 | |
| Alexa Fluor 546 faloidina conjugada com corante | Tecnologias da Vida | A-22283 | |
| Reagentes de montagem | |||
| Micro vidro deslizante | Matsunami Glass Ind., Ltd. | SS7213 | |
| Vidro de cobertura quadrado para microscópio | Matsunami Glass Ind., Ltd. | C218181 | |
| Reagente FluorSave (Reagente de montagem) | Calbioquímica | 345789 | |
| Pipeta de transferência 1 ml (conta-gotas descartável) | Watson | 5660-222-1S | |
| Estoques de moscas | |||
| w; GMR45C06-GAL4 | do Bloomington Drosophila Stock Center. (#46260) | ||
| UAS-GFP; UAS–mCD8::GFP | presentes de K. Ito, Universidade de Tóquio. | ||
| w[1118] | |||
| w; phantom-GAL4#22/UAS-turboRFP | |||
| w; UAS-mCD8::GFP; TRH-GAL4 | Li, H. H. (2014) e Alekseyenko, O. V, Lee, C. & Kravitz, E. A. (2010) | ||
| w; UAS-mCD8::GFP | do Bloomington Drosophila Stock Center. (#32188) | ||
| yw;; nSyb-GAL4 | do Bloomington Drosophila Stock Center. (#51941) |
