Migração de linfócitos T ocorre durante homing para órgãos linfóides, saia do vasculatura, e entrando em tecidos periféricos. Aqui, nós descrevemos um protocolo que pode ser usado para analisar migração de linfócitos T<em> In vitro</em>.
Abstract
A migração de linfócitos T envolve a interação adesivo de integrinas da superfície celular com ligantes expressos em outras células ou com proteínas da matriz extracelular. A ativação das integrinas preciso espaço-temporal de um estado de baixa afinidade para um estado de alta afinidade no limite da célula líder é importante para a migração de linfócitos T<sup> 1</sup>. Da mesma forma, a retração da borda das células à direita, ou uropod, é um passo necessário na manutenção persistente integrina-dependente motilidade linfócitos T<sup> 2</sup>. Muitas abordagens terapêuticas para auto-imunes ou inflamatórias integrinas doenças-alvo, como forma de inibir o recrutamento excessivo e migração dos leucócitos<sup> 3</sup>. Para estudar os eventos moleculares que regulam a migração de linfócitos T humanos, nós utilizamos um<em> In vitro</em> Sistema para analisar a migração de células em um substrato bidimensional que imita o ambiente que um linfócito T encontra durante o recrutamento da vasculatura. Linfócitos T são os primeiros isolados de doadores humanos e são, então, estimulado e cultivado por sete a dez dias. Durante o ensaio, os linfócitos T estão autorizados a aderir e migrar sobre um substrato revestido com uma molécula de adesão intercelular (ICAM-1), um ligante de integrina LFA-1, eo fator-1 de células derivadas do estroma (SDF-1). Nossos dados mostram que os linfócitos T apresentam uma velocidade de migração de ~ 15 mm / min. Migração de linfócitos T podem ser inibidos pelo bloqueio integrina<sup> 1</sup> Ou por inibidores da máquina actomyosin celular que regula a migração celular<sup> 2</sup>.
Protocol
1. Isolamento de linfócitos T humanos Obter sangue humano a partir de um doador saudável. Permitir que o sangue esfriar até a temperatura ambiente (~ 30 min) antes de prosseguir para a próxima etapa. Suavemente pipeta de 3 mL de temperatura ambiente Polymorph media gradiente de densidade em um tubo de poliestireno 8 mL de fundo redondo. Delicadamente adicionar 3 mL de sangue total em cima da mídia Polymorph. É importante evitar a mistura dos dois reagentes. Centrifugar os tubos a 500…
Discussion
Neste experimento, nós fornecemos detalhes sobre um sistema simples para analisar a motilidade do principal linfócitos T humanos. Ensaios de migração in vitro têm sido usadas para dissecar os papéis de muitas moléculas e vias de sinalização envolvidas na locomoção de vários tipos de células. Alguns controles fundamentais para manter em mente ao projetar sua própria experiência de nosso protocolo incluem: 1) não-adesiva ou não-integrina revestimentos adesivos, substratos tais como album…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este projecto foi apoiado pelo National Institutes of Health Grants HL087088 (MK) e HL18208 (MK).