O protocolo descreve o knockdown direcionado da expressão genética em zebrafish por injeção de morfolino na cauda.
Protocol
1. Injeção de Morfolino Um dia antes de injetar o morfolino, faça uma placa de injeção(Figura 1). Certifique-se de cortar um entalhe em uma extremidade do poço, o que ajuda a estabilizar o peixe para o procedimento de microinjeção. Diluir o morpholino marcado por fluoresceína para a concentração adequada (recomendo começar com 1,2 mM) e coloque em um banho de água de 65 °C, por 5 minutos. Carregue a agulha com o morfolino (nota:</strong…
Representative Results
Figura 1. A. Esquema da placa de injeção, que é feita de agarose e contém um pequeno poço para segurar o peixe durante a microinjeção do morfelino. Figura 2. Esquema de microinjeção de morfolino. A. Coloque o peixe no prato com a cabeça do peixe no entalhe cortado do…
Materials
Morpholino
GeneTools, LLC
Morpholino should be custom designed to your protein of interest
Micro-injection pump
World Precision Instruments, Inc.
PV830
Pneumatic PicoPump Many different microinjection systems could be used
Micro-manipulator
World Precision Instruments, Inc.
MMJR
Right-handed (MMJL for lefthanded)
Micro-injection needles, 1.0 mm outside diameter
World Precision Instruments, Inc.
1B100F-4
These are borosilicate glass capillaries, pulled into a needle
Needle holder
World Precision Instruments, Inc.
5430-ALL
Pico Nozzle Kit; make sure to inset the 1.0 mm pipette gasket
Needle puller
Sutter Instrument Co.
P-97
Other micropipette/needle pullers should also work
Microscope
Leica, Nikon, Zeiss
Number varies depending on the manufacturer
Any stereomicroscope with 20X optics and the ability to work with micromanipulators
2-Phenoxyethanol
Sigma-Aldrich
77861-1L
Anesthesia; dilute 1:1000 in fish system water for procedure, 1:500 for euthanasia
Morpholino Injection: A Method to Knockdown Target Gene Expression to Study Function in Zebrafish. J. Vis. Exp. (Pending Publication), e20182, doi: (2023).