Montage de l’agar en couches : Préparation d’embryons vivants de poisson zèbre pour l’imagerie à long terme au microscope inversé

Abstract

Source: Upadhyay S., et.al. Une méthode de montage en couches pour la microscopie confoccale prolongée de temps-Lapse des embryons entiers de poisson zèbre. J. Vis. Exp. (2020).

Cet article décrit une méthode pour monter des embryons vivants de poisson zèbre pour l’imagerie à long terme. Cette méthode est rentable et facile à utiliser en utilisant des microscopies régulières à fond de verre pour l’imagerie au microscope inversé. Le montage est effectué en couches d’agarose à différentes concentrations.

Protocol

1. Préparation d’embryons Après l’accouplement, récolter les embryons en E3 dans une boîte de Pétri et les incuber à 26,5 °C pendant environ 28 h avant de monter.REMARQUE: Cela ralentit le développement des embryons de sorte que les embryons sont d’environ 30 stade somite au début de l’imagerie. Anesthésier les embryons en 0,016-0,020% Tricaine à l’E3. Pour inhiber la pigmentation, ajouter la PTU à une concentration de 200 μM. Dé…

Representative Results

Figure 1 : Description de la méthode de montage. (A) Ajouter l’embryon de poisson zèbre au petit puits créé par le fond de verre dans le plat de 35 mm. (B) Ajouter la couche d’agarose 1 au petit puits pour couvrir l’embryon. (C) Placer délicatement un verre de couverture sur le petit puits. (D) Ajouter la couche d’agarose 2 sur tout le fond du plat de 35 mm. (E) Ajouter l’E3 au plat. (F) Dessin schématique…

Materials

Low melting agarose	Sigma-Aldrich, MO	A9414	Store dissolved solution at 4 °C
35 mm glass bottom dishes with No. 0 coverslip and 10 mm diameter of glass bottom	MatTek Corporation, MA	P35GCOL-0-10-C
Tricaine (MS-222)	Sigma-Aldrich, MO	E10521	Store dissolved solution at 4 °C
N-phenylthiourea (PTU)	Sigma-Aldrich, MO	P7629	Store dissolved solution at -20 °C
DMC4500 digital microscope camera	Leica	NA
Micro cover glass 22×22 mm	VWR	48366 067