Layered Agar Mounting: Vorbereitung lebender Zebrafisch-Embryonen für Langzeitaufnahmen mit einem invertierten Mikroskop

Abstract

Quelle: Upadhyay S., et.al. Eine geschichtete Montagemethode für die verlängerte Zeitraffer-Konfokalmikroskopie ganzer Zebrafisch-Embryonen. J. Vis. (2020).

Dieser Artikel beschreibt eine Methode, um lebende Zebrafisch-Embryonen für die Langzeitbildgebung zu montieren. Diese Methode ist kostengünstig und einfach mit regulären Glasbodenmikroskopie-Geschirr für die Bildgebung auf invertiertem Mikroskop durchzuführen. Die Montage erfolgt in Agaroseschichten in unterschiedlichen Konzentrationen.

Protocol

1. Zubereitung von Embryonen Nach der Paarung Embryonen in E3 in einer Petrischale ernten und bei 26,5 °C ca. 28 h vor der Montage bebrüten.HINWEIS: Dies verlangsamt die Entwicklung der Embryonen, so dass die Embryonen zu Beginn der Bildgebung etwa 30 Jahre alt sind. Anästhetisieren Sie Embryonen in 0,016-0,020% Tricain in E3. Um die Pigmentierung zu hemmen, fügen Sie PTU zu einer Konzentration von 200 M hinzu. Dechorionate die Embryonen mit Zangen …

Representative Results

Abbildung 1: Beschreibung der Montagemethode. (A) Fügen Sie den Zebrafisch-Embryo zu dem kleinen Brunnen hinzu, der durch den Glasboden in der 35 mm Schale geschaffen wurde. (B) Fügen Sie der Agaroseschicht 1 den kleinen Brunnen hinzu, um den Embryo zu bedecken. (C) Legen Sie vorsichtig ein Deckglas über den kleinen Brunnen. (D) Agaroseschicht 2 auf den gesamten Boden der 35 mm Schale geben. (E) E3 zum Gericht hinzufü…

Materials

Low melting agarose	Sigma-Aldrich, MO	A9414	Store dissolved solution at 4 °C
35 mm glass bottom dishes with No. 0 coverslip and 10 mm diameter of glass bottom	MatTek Corporation, MA	P35GCOL-0-10-C
Tricaine (MS-222)	Sigma-Aldrich, MO	E10521	Store dissolved solution at 4 °C
N-phenylthiourea (PTU)	Sigma-Aldrich, MO	P7629	Store dissolved solution at -20 °C
DMC4500 digital microscope camera	Leica	NA
Micro cover glass 22×22 mm	VWR	48366 067