הרכבה בשכבות אגר: הכנת עוברי זברה חיים להדמיה ארוכת טווח עם מיקרוסקופ הפוך
Published: April 30, 2023
Abstract
מקור: Upadhyay S., et.al. שיטת הרכבה שכבתית למיקרוסקופיה קונפוקלית ארוכת טווח של עוברי זברה שלמים. ג’יי ויס אקספ. (2020).
מאמר זה מתאר שיטה להרכבת עוברי זברה חיים להדמיה ארוכת טווח. שיטה זו חסכונית וקלה לביצוע באמצעות מנות מיקרוסקופיות רגילות עם תחתית זכוכית להדמיה במיקרוסקופ הפוך. ההרכבה מבוצעת בשכבות של agarose בריכוזים שונים.
Protocol
1. הכנת עוברים לאחר ההזדווגות, קוצרים עוברים ב- E3 בצלחת פטרי ומדגרים אותם ב-26°C למשך כ-28 שעות לפני ההרכבה.שים לב: זה מאט את התפתחות העוברים כך שהעוברים נמצאים בערך בשלב 30 סומיט בתחילת ההדמיה. יש למרדים עוברים ב-0.016-0.020% טריקאין ב-E3. כדי לעכב פיגמנטציה, להוסיף PTU לר?…
Representative Results
איור 1 : תיאור שיטת ההרכבה. (א) מוסיפים את עובר הזברה לבאר הקטנה שנוצרה על ידי תחתית הזכוכית בצלחת 35 מ”מ. (B) מוסיפים שכבה 1 לבאר הקטנה כדי לכסות את העובר. (ג) מניחים בזהירות כיסוי מעל הבאר הקטנה. (ד) מוסיפים שכבת אגרוז 2 על כל החלק התחתון של צל?…
Materials
| Low melting agarose | Sigma-Aldrich, MO | A9414 | Store dissolved solution at 4 °C |
| 35 mm glass bottom dishes with No. 0 coverslip and 10 mm diameter of glass bottom | MatTek Corporation, MA | P35GCOL-0-10-C | |
| Tricaine (MS-222) | Sigma-Aldrich, MO | E10521 | Store dissolved solution at 4 °C |
| N-phenylthiourea (PTU) | Sigma-Aldrich, MO | P7629 | Store dissolved solution at -20 °C |
| DMC4500 digital microscope camera | Leica | NA | |
| Micro cover glass 22×22 mm | VWR | 48366 067 |
Citar este artigo
Layered Agar Mounting: Preparing Live Zebrafish Embryos for Long-Term Imaging with an Inverted Microscope. J. Vis. Exp. (Pending Publication), e20186, doi: (2023).