Montaje de agar en capas: Preparación de embriones de pez cebra vivo para imágenes a largo plazo con un microscopio invertido

Abstract

Fuente: Upadhyay S., et.al. Un método de montaje en capas para microscopía confocal de lapso de tiempo extendido de embriones de pez cebra entero. J. Vis. (2020).

En este artículo se describe un método para montar embriones de pez cebra vivos para obtener imágenes a largo plazo. Este método es rentable y fácil de realizar utilizando platos regulares de microscopía con fondo de vidrio para obtener imágenes en el microscopio invertido. El montaje se realiza en capas de agarose a diferentes concentraciones.

Protocol

1. Preparación de embriones Después del apareamiento, coseche embriones en E3 en una placa de Petri e incubarlos a 26,5 °C durante aproximadamente 28 h antes de montarlos.NOTA: Esto ralentiza el desarrollo de los embriones para que los embriones estén aproximadamente en 30 etapas de somite al comienzo de la toma de imágenes. Embrións anestesiados en 0,016-0,020% Tricarina en E3. Para inhibir la pigmentación, añadir PTU a una concentración de 200 μM.</li…

Representative Results

Figura 1 : Descripción del método de montaje. (A) Añadir el embrión de pez cebra al pequeño pozo creado por el fondo de vidrio en el plato de 35 mm. (B) Añadir la capa de agarose 1 al pequeño pozo para cubrir el embrión. (C) Coloque cuidadosamente un vaso de cubierta sobre el pequeño pozo. (D) Añadir la capa de agarose 2 en toda la parte inferior del plato de 35 mm. (E) Añadir E3 al plato. (F) Dibujo esquemáti…

Materials

Low melting agarose	Sigma-Aldrich, MO	A9414	Store dissolved solution at 4 °C
35 mm glass bottom dishes with No. 0 coverslip and 10 mm diameter of glass bottom	MatTek Corporation, MA	P35GCOL-0-10-C
Tricaine (MS-222)	Sigma-Aldrich, MO	E10521	Store dissolved solution at 4 °C
N-phenylthiourea (PTU)	Sigma-Aldrich, MO	P7629	Store dissolved solution at -20 °C
DMC4500 digital microscope camera	Leica	NA
Micro cover glass 22×22 mm	VWR	48366 067