Montagem em ágar em camadas: Preparando embriões vivos de peixe-zebra para imagens de longo prazo com um microscópio invertido

Resumo

Fonte: Upadhyay S., et.al. Um método de montagem em camadas para microscopia confocal de lapso de tempo estendido de embriões inteiros de peixe-zebra. J. Vis. Exp. (2020).

Este artigo descreve um método para montar embriões vivos de peixe-zebra para imagens de longo prazo. Este método é econômico e fácil de executar usando placas de microscopia com fundo de vidro comuns para imagens em microscópio invertido. A montagem é realizada em camadas de agarose em diferentes concentrações.

Protocolo

1. Preparação de embriões

1. Após o acasalamento, colha os embriões em E3 em uma placa de Petri e incube-os a 26,5 ° C por cerca de 28 h antes da montagem.
   nota: Isso retarda o desenvolvimento dos embriões, de modo que os embriões estão aproximadamente no estágio 30 de somito no início da imagem.
2. Anestesiar embriões em 0,016-0,020% de Tricaína em E3. Para inibir a pigmentação, adicione PTU a uma concentração de 200 μM.
3. Descorione os embriões usando fórceps sob um microscópio de dissecação. Usando duas pinças, segure e separe suavemente o córion para liberar o embrião.

Resultados

Figura 1 : Descrição do método de montagem. (A) Adicione o embrião de peixe-zebra ao pequeno poço criado pelo fundo de vidro no prato de 35 mm. (B) Adicione a camada de agarose 1 ao pequeno poço para cobrir o embrião. (C) Coloque cuidadosamente uma tampa de vidro sobre o pequeno poço. (D) Adicione a camada de agarose 2 em todo o fundo do prato de 35 mm. (E) Adicione E3 ao prato. (F) Desenho esquemático de uma seção trans.......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Baixo ponto de fusão de agarose	Sigma-Aldrich, MO	A9414	Conservar a solução dissolvida a 4 °C
Pratos com fundo de vidro de 35 mm com lamínula nº 0 e fundo de vidro com 10 mm de diâmetro	Corporação MatTek, MA	P35GCOL-0-10-C
Tricocaína (MS-222)	Sigma-Aldrich, MO	E10521	Conservar a solução dissolvida a 4 °C
N-feniltioureia (PTU)	Sigma-Aldrich, MO	Pág. 7629	Conservar a solução dissolvida a -20 °C
DMC4500 câmera digital para microscópio	Leica	NA
Micro vidro de cobertura 22x22 mm	VWR	Nº 48366 067