免疫電子顕微鏡のためのマウスの脳組織の準備
Summary
我々は経心臓的マウスの灌流、脳の除去と切片だけでなく、免疫ペルオキシダーゼ染色、樹脂の埋め込み、および脳切片の切片極薄のためのプロトコルについて説明します。これらの手順が完了すると、免疫染色の材料は、透過型電子顕微鏡による検査のための準備ができています。
Abstract
透過型電子顕微鏡（TEM）がで中枢神経系では、非常に、ミクログリア可視化に有用なオリゴデンドロサイト、アストロサイト、神経細胞内コンパートメント（樹状突起、樹状突起スパイン、軸索、軸索ターミナル、周核体）、ならびにそれらの細胞内小器官と細胞骨格です。高空間分解能。として提示さ、TEMと組み合わせることで、事前に埋め込み免疫細胞は、いくつかの特徴と識別基準（例えば、ミクログリアperikaryonの複数形やプロセス、ミクログリア特異的なマーカーIba1（イオン化カルシウム結合アダプター分子1に対して抗体を使用しているときに携帯電話の要素の識別を可能にここで））、神経伝達物質の細胞内要素の内容（例えば、セロトニン作動性）およびそれらの超微細構造の可溶性または膜結合タンパク質の局在化（例えば、5 HT1AおよびEphA4の受容体を）特定する。ここでは、アクロレイン固定液、脳の除去と切片だけでなく、免疫ペルオキシダーゼ – ジアミノベンジジン（DAB）染色、樹脂の埋め込み、および脳切片の切片極薄でマウスの経心臓的灌流のためのプロトコルについて説明します。これらの手順が完了すると、免疫染色の材料はTEMで試験の準備ができています。厳密に実行する場合は、この手法は、最適な微細構造の保全と免疫細胞化学的検出の間で優れた妥協点を提供します。
Protocol
Discussion
ここでは手続きが厳格に実行されるときに、最適な超微細構造の保全と免疫細胞化学的検出の間で優れた妥協点を提供する免疫電子顕微鏡のためのマウスの脳組織の準備のためのプロトコルを記述している。
TEMと組み合わせることで、この方法はいくつかの特徴と識別基準に携帯電話の要素を区別することができます。特に、Iba1の免疫ペルオキシダーゼ- DAB染色では神?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
我々は技術支援のためのロチェスター大学医療センターの電子顕微鏡研究の中核施設で、蠕動ポンプとビブラトームの使用だけでなく、カレンL. Bentleyとゲイルシュナイダーのために少明陸とハリスA. Gelbardに感謝。この作品は、NIH（EY019277）、ホワイトホール財団、バローズウェルカム基金、及びAKMのアルフレッドP.スローン財団からの補助金によって賄われていた。 M.-È.T.フォンデラ凝ったエンサンテケベック（FRSQ）ポスドクトレーニングの賞によって運営されている。
Materials
| Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Sodium pentobarbital (Nembutal) | Ovation Pharmaceuticals | |||
| Filter paper 315 24 cm | VWR | 28331-081 | ||
| *Acrolein purum (≥95%) | Sigma-Aldrich (Fluka) | 01680 | ||
| Sodium borohydride (≥98%) | Sigma-Aldrich (Aldrich) | 452173 | ||
| *Prilled paraformaldehyde (PFA) (95%) | Sigma-Aldrich | 441244 | ||
| Normal goat serum | Jackson ImmunoResearch | 005-000-121 | ||
| Rabbit anti-Iba1 primary antibody | Wako | 019-19741 | Stored at -20°C, 1:1 in glycerol | |
| Biotin-SP-conjugated AffiniPure F(ab’)2 fragment goat anti-rabbit IgG, Fc fragment specific | Jackson ImmunoResearch | 111-066-046 | Stored at -20°C, 1:1 in glycerol | |
| Peroxidase-conjugated streptavidin | Jackson ImmunoResearch | 016-030-084 | Stored at -20°C, 1:1 in glycerol | |
| *Osmium tetroxide 4% solution | Electron Microscopy Sciences | 19150 | Light sensitive | |
| Propylene oxide (≥99%) | Sigma-Aldrich (Fluka) | 82325 | ||
| Polypropylene disposable beakers (50 mL) | Fisher | 01-291-10 | ||
| Aluminium weigh dishes (70 mm) | Fisher | NC9261784 | ||
| Durcupan epoxy resin | Electron Microscopy Sciences | 14040 | ||
| Embedding mold | Electron Microscopy Sciences | 70907 | ||
| DPX mountant for histology | Sigma-Aldrich (BioChemika) | 44581 | ||
| Gelatin subbed slides | VWR | 100241-864 | ||
| ACLAR embedding films (7.8 mm) | Electron Microscopy Sciences | 50425 | ||
| Capsule mold | Electron microscopy Sciences | 70150 | ||
| High-performance super glue | Corporate Express | LOC30379 | ||
| Perfect loop for ultra thin sections | Electron Microscopy Sciences | 70944 | ||
| Superfrost slides | Fisher | 22-178-277 | ||
| Diamond knife ultra 45° (2.5-3.5 mm) | Diatome | |||
| Gelatin from cold water fish skin (~45%) | Sigma-Aldrich (Sigma) | G7765 |
*One should always work under a fume hood and wear nitrile gloves when handling acrolein, paraformaldehyde, and osmium and should also dispose of their waste properly.
Referências
- Venable, J. H., Coggeshall, R. A simplified lead citrate stain for use in electron microscopy. J Cell Biol. 25, 407-407 (1965).
- Riad, M. Somatodendritic localization of 5-HT1A and preterminal axonal localization of 5-HT1B serotonin receptors in adult rat brain. J Comp Neurol. 417 (2), 181-181 (2000).
- Tremblay, M. E. Localization of EphA4 in axon terminals and dendritic spines of adult rat hippocampus. J Comp Neurol. 501 (5), 691-691 (2007).
- Tremblay, M. E. Developmental course of EphA4 cellular and subcellular localization in the postnatal rat hippocampus. J Comp Neurol. 512 (6), 798-798 (2009).
- Bouvier, D. Pre-synaptic and post-synaptic localization of EphA4 and EphB2 in adult mouse forebrain. J Neurochem. 106 (2), 682-682 (2008).
- Bouvier, D. EphA4 is localized in clathrin-coated and synaptic vesicles in adult mouse brain. J Neurochem. , (2010).
