Se describe un protocolo para la perfusión transcardiaca de los ratones, la eliminación y la sección del cerebro, así como la tinción con inmunoperoxidasa, la incrustación de resina, y ultrafinas de seccionamiento de las secciones del cerebro. Al término de estos procedimientos, el material immunostained está listo para el examen con microscopio electrónico de transmisión.
Microscopía electrónica de transmisión (TEM) es extremadamente útil para la visualización de los compartimentos microglial, subcelular oligodendrocíticos, astrocitos y neuronas (las dendritas, la espina dendrítica, axón, axón terminal, pericarion), así como sus organelos intracelulares y el citoesqueleto, en el sistema nervioso central en alta resolución espacial. En combinación con TEM, pre-incrustación inmunocitoquímica permite la discriminación de los elementos celulares con algunos rasgos distintivos y los criterios de identificación (por ejemplo, la microglia perikarya y procesos, cuando se utiliza un anticuerpo contra el marcador de microglia específicos Iba1 (molécula ionizada de unión de calcio adaptador 1, tal como se presenta aquí)), la identificación de los contenidos de neurotransmisores de los elementos celulares (por ejemplo, serotoninérgicos) y su localización ultraestructural de las proteínas solubles o de membrana (por ejemplo, 5 HT1A y los receptores de EphA4). Aquí se describe un protocolo para la perfusión transcardiaca de ratones con acroleína fijador, la eliminación y la sección del cerebro, así como inmunoperoxidasa-tinción Diaminobencidina (DAB), la incrustación de resina, y ultrafinas de seccionamiento de las secciones del cerebro. Al término de estos procedimientos, el material immunostained está listo para el examen de TEM. Cuando se realiza con rigor, esta técnica proporciona un excelente compromiso entre la conservación óptima ultraestructurales y detección inmunohistoquímica.
Aquí hemos descrito un protocolo de preparación de tejido ratón cerebro para microscopía immunoelectron que proporciona un excelente compromiso entre conservación óptima ultraestructurales y detección inmunocitoquímicas, cuando los procedimientos son rigurosamente realizado.
Combinado con TEM, este método permite distinguir elementos celulares con pocos características distintivas y criterios identificación. En particular, el tinción inmunoperoxidasa-DAB de Iba1 permite identific…
The authors have nothing to disclose.
Damos las gracias a Shao-Ming Lu y A. Harris Gelbard para el uso de una bomba peristáltica y vibratome, así como Karen L. Bentley y Schneider Gayle en el Fondo para el núcleo Microscopio Electrónico de Investigación de la Universidad de Rochester Medical Center para la asistencia técnica. Este trabajo fue financiado por subvenciones del NIH (EY019277), la Fundación de Whitehall, Burroughs Wellcome Fund, y la Fundación Alfred P. Sloan de AKM. M.-È.T. es financiado por una Fonds de la recherche en santé du Québec (FRSQ) Premio formación postdoctoral.
Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
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Sodium pentobarbital (Nembutal) | Ovation Pharmaceuticals | |||
Filter paper 315 24 cm | VWR | 28331-081 | ||
*Acrolein purum (≥95%) | Sigma-Aldrich (Fluka) | 01680 | ||
Sodium borohydride (≥98%) | Sigma-Aldrich (Aldrich) | 452173 | ||
*Prilled paraformaldehyde (PFA) (95%) | Sigma-Aldrich | 441244 | ||
Normal goat serum | Jackson ImmunoResearch | 005-000-121 | ||
Rabbit anti-Iba1 primary antibody | Wako | 019-19741 | Stored at -20°C, 1:1 in glycerol | |
Biotin-SP-conjugated AffiniPure F(ab’)2 fragment goat anti-rabbit IgG, Fc fragment specific | Jackson ImmunoResearch | 111-066-046 | Stored at -20°C, 1:1 in glycerol | |
Peroxidase-conjugated streptavidin | Jackson ImmunoResearch | 016-030-084 | Stored at -20°C, 1:1 in glycerol | |
*Osmium tetroxide 4% solution | Electron Microscopy Sciences | 19150 | Light sensitive | |
Propylene oxide (≥99%) | Sigma-Aldrich (Fluka) | 82325 | ||
Polypropylene disposable beakers (50 mL) | Fisher | 01-291-10 | ||
Aluminium weigh dishes (70 mm) | Fisher | NC9261784 | ||
Durcupan epoxy resin | Electron Microscopy Sciences | 14040 | ||
Embedding mold | Electron Microscopy Sciences | 70907 | ||
DPX mountant for histology | Sigma-Aldrich (BioChemika) | 44581 | ||
Gelatin subbed slides | VWR | 100241-864 | ||
ACLAR embedding films (7.8 mm) | Electron Microscopy Sciences | 50425 | ||
Capsule mold | Electron microscopy Sciences | 70150 | ||
High-performance super glue | Corporate Express | LOC30379 | ||
Perfect loop for ultra thin sections | Electron Microscopy Sciences | 70944 | ||
Superfrost slides | Fisher | 22-178-277 | ||
Diamond knife ultra 45° (2.5-3.5 mm) | Diatome | |||
Gelatin from cold water fish skin (~45%) | Sigma-Aldrich (Sigma) | G7765 |
*One should always work under a fume hood and wear nitrile gloves when handling acrolein, paraformaldehyde, and osmium and should also dispose of their waste properly.