Todos os procedimentos envolvendo modelos animais foram revisados pelo comitê institucional local de cuidados com animais e pelo conselho de revisão veterinária JoVE.
1. Animais, reagentes e equipamentos experimentais
- Use camundongos com idade e sexo correspondentes. Comece o estudo com 7-9 semanas de idade porque a pele na maioria dos camundongos está em telógeno (a fase de repouso) por volta dessa idade.
- Observe o comportamento dos animais durante o estudo e se eles lutarem, o que geralmente acontece com os machos, abrigue-os separadamente. As brigas podem causar cortes na pele, que promovem a formação de tumores. Os camundongos fêmeas são preferidos devido ao seu comportamento menos agressivo. O tamanho típico do grupo experimental varia entre 8 e 20 animais por grupo.
nota: Os cálculos de poder baseados na variância biológica observada em estudos anteriores ajudam a escolher um tamanho de grupo suficientemente grande. As cepas usadas como exemplos neste artigo incluem Balb / c e C57BL / 6. No entanto, muitas outras linhagens de camundongos, como SENCAR e FVB, foram usadas com o modelo DMBA-TPA e ratos Wistar e Sprague-Dawley. Uma licença do comitê nacional ou local de trabalho com animais é necessária antes do início do estudo. Além das considerações gerais de bem-estar, os desfechos específicos do modelo são tipicamente carcinoma de células escamosas (CEC) e infecção da pele. Arranhões na pele devido à coceira após a aplicação dos produtos químicos tumorigênicos na acetona são típicos, mas, caso contrário, os animais não devem mostrar sinais de desconforto. Pesar regularmente (por exemplo, 2x por mês) ajuda a avaliar o bem-estar dos animais.
- Use DMBA e TPA, ambos diluídos em acetona. A concentração de trabalho do DMBA é de 250 g/L. Uma dose para um animal é de 50 μg de DMBA em 200 μL de acetona. A concentração de estoque de TPA é de 125 g/L e a concentração de tratamento de 25 g/L. Uma dose de TPA para um animal é de 5 μg em 200 μL de acetona.
CUIDADO: O DMBA é prejudicial se ingerido e pode causar câncer. A acetona evapora rapidamente e é inflamável. Pode causar tonturas e irritar os olhos. Use uma máscara respiratória e/ou trabalhe sob um fluxo de vácuo. Troque as luvas após manusear qualquer um desses produtos químicos. Gaiolas ventiladas individualmente evitam a propagação dos produtos químicos durante o alojamento dos ratos. Após a aplicação, reúna as pontas das pipetas utilizadas para o manuseio do DMBA e descarte-as como resíduos perigosos.
nota: O DMBA deve ser protegido da luz. O TPA diluído é armazenado a -20 °C, de preferência protegido da luz.
- Adquira o seguinte equipamento: uma balança, um barbeador comum para o pelo, pipetas e pontas de tamanho apropriado, uma régua comum, uma câmera digital, um bloco de notas e uma caneta ou um computador para registrar os papilomas, um sistema de anestesia inalada ou um limitador de camundongo com uma abertura na parte superior traseira e um sistema de narcose de dióxido de carbono para sacrificar camundongos.
2. Indução e Promoção do Papiloma Cutâneo
- Raspe a pele das costas e pese o animal. Posteriormente, raspe a pele sempre que necessário, mas não no momento da exposição ao produto químico.
nota: Tenha cuidado ao fazer a barba ao redor dos papilomas e evite fazer cortes na pele. Pese cada animal a cada 2 semanas para notar qualquer perda de peso potencial.
- Aplique 50 μg de DMBA em 200 μL de acetona topicamente na área raspada usando uma pipeta 48 h após raspar o pelo. Se necessário, contenha o animal usando anestesia leve por inalação ou um contenção de camundongos.
- Após 7 dias, dê a primeira dose de TPA. Aplicar 5 μg de TPA em 200 μL de acetona topicamente com uma pipeta 2x por semana, de preferência segunda e quinta ou terça e sexta-feira.
- Conte, registre e fotografe os papilomas todas as semanas. Uma massa palpável maior que 1 mm de diâmetro é considerada um papiloma se permanecer por mais de 1 semana. Marque cada papiloma individual em um mapa e liste seu tamanho todas as semanas - armazene fotografias digitais.
