Coloração de anticorpos de melanócitos de escamas: uma técnica para detectar fatores de transcrição expressos em melanócitos associados a escamas dorsais de modelos de peixe-zebra

Resumo

Fonte: Sharanya Iyengar et al. Triagem de modificadores de melanoma usando um modelo de tumor autóctone de peixe-zebra. J. Vis. Exp. (2012)

Este vídeo descreve o método de coloração de anticorpos para detectar a expressão de fatores de transcrição em melanócitos associados à escama dorsal de modelos de peixe-zebra. Essa técnica de imunocoloração ajuda a identificar especificamente o fator de transfecção indutor de melanócitos-A no peixe-zebra transgênico.

Protocolo

Todos os procedimentos envolvendo modelos animais foram revisados pelo comitê institucional local de cuidados com animais e pelo conselho de revisão veterinária JoVE.

1. Coloração de anticorpos de melanócitos de escamas

1. Fazer o tampão PO₄ com 80 mL 0,1M Na₂HPO₄ e 20 mL 0,1M NaH₂PO₄. Certifique-se de que o pH seja 7,3. Faça 2x tampão fixo contendo 8,0g de sacarose, 0,15 mL 0,2M CaCl₂ e 90 mL 0,2M PO₄ tampão, pH 7,3. Se necessário, ajustar o pH a 7,3 com NaOH ou HCl e, em seguida, completar o volume até 100 ml com tampão PO₄.

Resultados

Figura 1. Coloração de anticorpos de melanócitos de escamas. A) Escamas sendo arrancadas de um peixe-zebra miniCoopR-EGFP anestesiado. B) Escama não branqueada com melanócitos pigmentados e C) escama branqueada de peixe-zebra miniCoopR-EGFP. Barra de escala = 100 μM. Escala não branqueada corada com um anticorpo D).......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Reagentes de recombinação de gateway	Invitrogen
miniCoopR
Anticorpo Mitfa
Anticorpo IgG anti-coelho de cabra FITC	Invitrogen
Vectashield	Laboratórios de vetores	H-1000
casper Peixe-zebra
Seringa 701N 10 μl	Hamilton / Fisher	14-824
FBS	Invitrogen	26140079