के अलगाव के लिए विधि Francisella tularensis बाहरी झिल्ली

Summary

से आंतरिक और बाहरी झिल्ली को अलग करने के लिए एक प्रोटोकॉल<em> Francisella tularensis</em> Spheroplasting, आसमाटिक lysis, और sucrose घनत्व ढाल ultracentrifugation के द्वारा.

Abstract

Francisella tularensis एक ग्राम नकारात्मक intracellular coccobacillus और जूनोटिक बीमारी tularemia की प्रेरणा का एजेंट है. जब अन्य बैक्टीरियल रोगज़नक़ों, बेहद कम संक्रामक खुराक (<10 CFU), तेजी से रोग प्रगति, और उच्च रुग्णता और मृत्यु दर सुझाव है कि Francisella की विषमय उपभेदों उपन्यास विषैलापन कारकों के लिए सांकेतिक शब्दों में बदलना के साथ तुलना में. भूतल उजागर अणु, अर्थात् बाहरी झिल्ली प्रोटीन (OMPs), बैक्टीरियल मेजबान सेल बंधन, प्रविष्टि, intracellular अस्तित्व, डाह और प्रतिरक्षा चोरी को बढ़ावा देने के दिखाया गया है. OMPs अध्ययन के लिए प्रासंगिकता आगे तथ्य यह है कि वे बैक्टीरियल बीमारियों की एक संख्या के खिलाफ रक्षात्मक के टीके के रूप में सेवा कर सकते हैं रेखांकित किया है. जबकि OMPs थोक centrifugation और / या डिटर्जेंट निष्कर्षण द्वारा पीछा कोशिकाओं के sonication सहित झिल्ली निष्कर्षण तकनीकों, के माध्यम से ग्राम नकारात्मक बैक्टीरिया से निकाला जा सकता है है, इन तैयारियों अक्सर periplasmic और / या cytoplasmic (आंतरिक) झिल्ली contaminants के (आईएम) के साथ दूषित कर रहे हैं. साल के लिए, ग्राम नकारात्मक आईएम और बाहरी झिल्ली के जैव रासायनिक और biophysical जुदाई के लिए "सोने के मानक 'विधि (ओम) spheroplasting और आसमाटिक lysis विषय बैक्टीरिया को दिया गया है, sucrose के घनत्व ढाल centrifugation द्वारा पीछा किया. एक बार एक sucrose के ढाल पर स्तरित, OMS घनत्व प्रसन्नचित्त में अंतर के आधार पर आईएमएस से अलग किया जा सकता है, ओम में lipopolysaccharide उपस्थिति (LPS) बड़े पैमाने पर predicated माना जा रहा है. यहाँ, हम एक कठोर और अनुकूलित निकालने, समृद्ध, और एफ अलग विधि का वर्णन tularensis बाहरी झिल्ली और उनके संबद्ध OMPs.

Protocol

दिन 1: एफ tularensis थाली टीका प्लेट एफ के जमे हुए शेयर संस्कृतियों म्यूएलर-Hinton अगर पर tularensis 2.5% (/ खंड खंड) दाता बछड़ा सीरम, 2% (/ खंड खंड) IsoVitaleX, 0.1% (/ wt खंड) ग्लूकोज, और 0.025% (wt / खंड) लोहे पाइरोफॉस्फेट के साथ पूरक है. एफ आगे बढ़ें 37 में लगभग 24 एच. के लिए डिग्री सेल्सियस 5% सीओ 2 के साथ tularensis दिन 2: एफ tularensis तरल मीडिया टीका कटियन समायोजित मध्यम म्यूएलर-Hinton (1.23 मिमी कैल्शियम क्लोराइड dihydrate और 1.03 मिमी मैग्नीशियम क्लोराइड hexahydrate युक्त) के 1 लीटर तैयार है और आटोक्लेव. जब 37 के लिए ठंडा डिग्री सेल्सियस, 0.1% (/ wt खंड) ग्लूकोज, 0.025% (wt / खंड) लोहे पाइरोफॉस्फेट, और (/ खंड खंड) 2% IsoVitaleX के साथ आगे पूरक मध्यम. बाँझ फ़िल्टर (0.22 μ) दो 500 मिलीलीटर aliquots में मध्यम. एक बाँझ 50 मिलीलीटर फाल्कन ट्यूब में पूरक मध्यम म्यूएलर Hinton और हस्तांतरण के 12 मिलीलीटर निकालें. एक बाँझ टीका 10 μl पाश का प्रयोग, एफ के एक बड़े loopful परिमार्जन tularensis अगर प्लेटें (1 दिवस से) और हस्तांतरण बैक्टीरिया से म्यूएलर-Hinton मध्यम (चरण 2 देखें) के 12 मिलीलीटर में वृद्धि हुई है. पिपेट समाधान एकाधिक बार clumps को तोड़ने के लिए और समरूप जीवाणु निलंबन तैयार. भंवर नहीं करो. एक बाँझ विंदुक का प्रयोग, चरण 3 से जीवाणु निलंबन के 5 मिलीग्राम के साथ प्रत्येक 500 मिलीलीटर पोत टीका लगाना. 37 में शोरबा संस्कृतियों ग्रो डिग्री सेल्सियस कोमल मिलाते हुए (एक नई ब्राउनश्विक इनोवा 2300 श्रृंखला हिलनेवाला पर 190-200 rpm) के साथ 14 से 18 घंटे के लिए. 3 दिन: Spheroplasting, आसमाटिक lysis और sucrose घनत्व ढाल centrifugation एफ प्राप्त मिलाते इनक्यूबेटर से tularensis संस्कृतियों और प्रत्येक 500 मिलीलीटर संस्कृति से 1 मिलीलीटर विभाज्य हटाने के लिए संबंधित ऑप्टिकल घनत्व की जांच. हम इष्टतम झिल्ली निष्कर्षण और अलगाव परिणाम मिल गया है जब एफ का उपयोग विकास है, जो 0.2 के बीच 0.4 (10 ~ 7 10 8 / CFU मिलीलीटर) एक 600 आयुध डिपो के साथ संबद्ध के प्रारंभिक लघुगणकीय चरण में tularensis कोशिकाओं. एक आयुध डिपो 600 0.2 से कम के साथ संस्कृतियों बाद sucrose gradients के लिए कुल झिल्ली सामग्री का पर्याप्त मात्रा में नहीं निकलेगा. इसके विपरीत, एक आयुध डिपो 600 0.4 (स्थिर चरण होने वाला) से अधिक के साथ संस्कृतियों के लिए मिश्रित झिल्ली fusions उपज पाया गया है . 30 मिनट के लिए 15 पर 7500 x जी पर संस्कृतियों अपकेंद्रित्र डिग्री सेल्सियस कोशिकाओं को इकट्ठा करने के लिए. हम चार 250 मिलीलीटर अपकेंद्रित्र बोतलों में संस्कृतियों के centrifugation सलाह देते हैं, क्योंकि यह बाद में गोली निलंबन की सुविधा. ध्यान से प्रत्येक अपकेंद्रित्र बोतल से मीडिया सतह पर तैरनेवाला हटाने और मजबूती शोषक सामग्री पर बोतलों का दोहन करने के लिए अतिरिक्त विकास मध्यम हटायें. 10 मिनट निम्नलिखित पूरा centrifugation के भीतर, 0.75 एम sucrose (5 मिमी Tris, 7.5 पीएच में) के 8.75 मिलीलीटर में प्रत्येक जीवाणु गोली निलंबित. सभी चार बैक्टीरियल छर्रों और निलंबित किया जाना चाहिए एक बाँझ फ्लास्क 250 मिलीलीटर (एक छोटी सी stirbar के साथ) (जीवाणु निलंबन की 35 मिलीलीटर कुल) 10 मिनट के भीतर स्थानांतरित. जबकि धीरे stirplate पर सेल निलंबन मिश्रण, धीरे धीरे 10 मिनट के पाठ्यक्रम पर 10 मिमी disodium EDTA के 70 मिलीलीटर (2 मात्रा) (5 मिमी Tris, 7.8 पीएच में) जोड़ें. सेल निलंबन के स्तर से नीचे पिपेट की नोक के साथ EDTA समाधान जोड़ें EDTA का ऊंचा स्थानीय सांद्रता से बचने के लिए. stirbar एक अच्छी तरह से मिश्रण सेल निलंबन नहीं बल्कि काफी तेजी से frothing या बुलबुला गठन के कारण पर्याप्त दर पर rotating होना चाहिए. EDTA समाधान के बाद जोड़ा गया है, कमरे के तापमान पर 30 मिनट के लिए समाधान सेते हैं. 30 मिनट ऊष्मायन के बाद, धीरे धीरे एक 2 मिलीग्राम / एमएल lysozyme 200 μg / मिलीलीटर की एक अंतिम एकाग्रता के समाधान के 11 मिलीलीटर (1 / 10 वें मात्रा) जोड़ें. Lysozyme समाधान इसके अलावा के दौरान सेल निलंबन मिश्रण जारी रखें. जैसा कि ऊपर उल्लेख किया, सेल निलंबन द्रव के स्तर से नीचे विंदुक टिप के साथ lysozyme समाधान जोड़ने के लिए lysozyme का ऊंचा स्थानीय सांद्रता से बचने. स्टॉक lysozyme समाधान (2 मिलीग्राम / एमएल) एकल उपयोग aliquots में तैयार किया जा सकता है और तीन से चार महीनों के लिए -20 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत. कमरे के तापमान पर 30 मिनट के लिए जिसके परिणामस्वरूप समाधान सेते हैं. 30 मिनट ऊष्मायन के दौरान, एक छोटे से stirbar और कमरे के तापमान Cellgro आण्विक ग्रेड DH 2 हे (4.5 संस्करणों) के 530 मिलीलीटर के साथ एक बाँझ 1L फ्लास्क तैयार . Osmotically धीमी गति कमजोर पड़ने (लगभग 11 मिलीलीटर / मिनट के प्रवाह की दर) के द्वारा आण्विक ग्रेड DH 2 हे सौम्य मिश्रण के साथ 10 से 15 मिनट के पाठ्यक्रम पर (चरण 7 से) के 530 मिलीलीटर में सेल निलंबन lyse (चरण 6 से). इस चरण में बड़ा समाधान की मात्रा के कारण, stirbar गति बढ़ाने के लिए उचित मिश्रण सुनिश्चित. दर अच्छी तरह से सेल निलंबन फैलाने के लिए पर्याप्त एक बार DH 2 हे जोड़ी पर घूर्णन stirbar होना चाहिए काफी तेजी से frothing या बुलबुला गठन के लिए नेतृत्व नहीं है, लेकिन. पिपेट की नोक कुप्पी के नीचे, stirbar करने के लिए आसन्न पर आराम के साथ सेल निलंबन जोड़ें, cel की वर्दी कमजोर पड़ने की सुविधामैं निलंबन. हमने पाया है कि 25 मिलीलीटर pipettes इस कदम के दौरान सबसे अच्छा काम करते हैं. ध्यान से कमजोर पड़ने की प्रक्रिया पर नजर रखने और प्रवाह के रूप में कोशिकाओं, सेल clumps, और सेल wisps के स्थानीय संचय फैलाने के लिए आवश्यक दर बीच में. कमरे के तापमान पर 30 मिनट के लिए जिसके परिणामस्वरूप समाधान सेते हैं. ध्यान दें कि इस कदम के लिए सबसे अधिक चुनौतीपूर्ण है और प्रयोग के समग्र सफलता के लिए महत्वपूर्ण प्रतीत होता है. 30 मिनट ऊष्मायन के बाद, 10 बजे 30 मिनट के लिए 7500 XG में 50 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूबों और अपकेंद्रित्र में आसमाटिक lysis समाधान के 40 मिलीलीटर aliquots हस्तांतरण सी बरकरार कोशिकाओं और मलबे को हटाने के लिए °. Centrifugation के बाद, ध्यान से प्रत्येक शंक्वाकार ट्यूब और पूल supernatants से सतह पर तैरनेवाला के एक बाँझ 1L फ्लास्क में 27 से 30 मिलीलीटर हटायें स्थानांतरण जमा सतह पर तैरनेवाला के 25 मिलीलीटर, 16 ultracentrifuge एक 2 घंटे के लिए 200,000 x 4 (F50L 8×39 FiberLite ultracentrifuge एक रोटर में 44,400 rpm) पर ° छ सी. ट्यूबों और अपकेंद्रित्र में प्रत्येक , ध्यान दें कि प्रत्येक रोटर 8 ट्यूबों रखती है, तो इस कदम दो रोटार और दो ultracentrifuges की आवश्यकता है. वैकल्पिक रूप से, 8 ट्यूबों के दूसरे सेट 4 में आयोजित किया जाना चाहिए डिग्री सेल्सियस जब तक centrifuged. Ultracentrifuge एक रन के पूरा होने के 10 मिनट के भीतर, झिल्ली resuspension बफर संशोधित तैयार करते हैं. एक बाँझ ट्यूब झिल्ली निलंबन बफर के 8 मिलीग्राम (25% [wt / wt] sucrose, 5 मिमी Tris, 30 मिमी 2 MgCl) स्थानांतरण और 1 EDTA मुक्त protease अवरोध करनेवाला कॉकटेल और Benzonase के 375 यू के गोली जोड़ें. धीरे समाधान का मिश्रण करने के लिए protease अवरोध करनेवाला गोली भंग. Ultracentrifugation के बाद, ध्यान से बंद supernatants डाल, शोषक सामग्री पर ultracentrifuge ट्यूबों पलटना, और दृढ़ता से ट्यूबों नल के लिए अतिरिक्त सतह पर तैरनेवाला हटायें. दृश्य में सहायता के लिए एक मार्कर के साथ प्रत्येक झिल्ली गोली के स्थान को मार्क. धीरे 600 μl संशोधित झिल्ली resuspension बफर के प्रत्येक के साथ आठ झिल्ली छर्रों resuspend. आठ ट्यूबों के अगले सेट के लिए प्रत्येक झिल्ली resuspension स्थानांतरण, धीरे से एक बाँझ ट्यूब में इन आठ छर्रों, और पूल परिणामस्वरूप झिल्ली resuspensions resuspend. pelleted झिल्ली के लिए resuspend मुश्किल हैं, तो गोली से अधिक संशोधित झिल्ली resuspension बफर गुजर जारी जब तक यह ट्यूब की दीवार से दूर peels. यह अक्सर है micropipette टिप का उपयोग ट्यूब की दीवार और सहायता बंद resuspension प्रक्रिया में झिल्ली गोली परिमार्जन करने के लिए आवश्यक है. जब pipetting, frothing से बचने या बुलबुला गठन. ध्यान दें कि इस कदम के लिए सबसे अधिक चुनौतीपूर्ण है और प्रयोग के समग्र सफलता के लिए महत्वपूर्ण प्रतीत होता है. जब झिल्ली छर्रों resuspended किया गया है और सभी 16 ट्यूब से हटा दिया, संशोधित झिल्ली resuspension बफर के 600 μl के साथ हर चार ट्यूबों धो लो. धोने प्रत्येक ट्यूब के रूप में चिह्नित क्षेत्र (झिल्ली गोली) के चारों ओर ध्यान केंद्रित किया जाना चाहिए. झिल्ली resuspension ट्यूब में धोने स्थानांतरण. चार ट्यूबों के शेष तीन सेट के लिए धोने के चरण को दोहराएँ. 30 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर flocculent सामग्री की कमी में डीएनए और सहायता नीचा कोमल कमाल के साथ झिल्ली resuspension सेते हैं. झिल्ली निलंबन के एक छोटे से विभाज्य निकालें और प्रोटीन की मात्रा का ठहराव प्रदर्शन करने के लिए कुल झिल्ली उपज निर्धारित. हम आम तौर पर undiluted तैयार, 01:01 (2.5% एसडीएस में) पतला, और 01:03 (2.5% एसडीएस में) में 90 झिल्ली नमूने, नमूनों गर्मी पतला 10 मिनट, और BioRad डीसी प्रोटीन परख का उपयोग करने के लिए यों के लिए डिग्री सेल्सियस झिल्ली resuspension प्रोटीन एकाग्रता. कुल प्रोटीन उपज 1.0 मिलीग्राम / एमएल और 1.6 मिलीग्राम / एमएल के बीच आम तौर पर है. गर्मी और एसडीएस का उपयोग करने के लिए इतना है कि एक और अधिक सटीक प्रोटीन की मात्रा का ठहराव मूल्य प्राप्त किया जा सकता निकाले झिल्ली से OMPs रिहाई के लिए आवश्यक हैं. : 55%, 50%, 45%, 14 x 95 मिमी निम्नलिखित क्रम में अल्ट्रा साफ ultracentrifuge एक ट्यूब में layering 1.8 मिलीलीटर sucrose के समाधान के प्रत्येक (wt / wt, 5 मिमी EDTA, 7.5 पीएच में तैयार) के द्वारा रैखिक sucrose gradients की तैयारी 40%, 35%, 30%. Sucrose gradients के Layering आसान है जब एक बल्ब, एक स्वचालित pipettor नहीं pipettor का उपयोग करने के लिए प्रदर्शन. Resuspension झिल्ली प्रोटीन (16 चरण) मात्रा का ठहराव, परत प्रत्येक ढाल के शीर्ष पर झिल्ली resuspension के 1.5 मिलीग्राम के आधार पर. प्रत्येक 14 x 95 मिमी ultracentrifuge ट्यूब 12.5 मिलीलीटर की एक अधिकतम क्षमता और, यह देखते हुए कि 10.8 मिलीलीटर के लिए 17 कदम से sucrose के समाधान के द्वारा हिसाब है, तुम ढाल के प्रति झिल्ली resuspension के 1.7 मिलीलीटर से अधिक लोड नहीं करना चाहिए. व्यक्तिगत वजन और समायोजित ध्यान से प्रत्येक sucrose ढाल ट्यूब (झिल्ली resuspension जोड़ने या हटाने के द्वारा) के अंतिम वजन इतना है कि सभी ट्यूब एक ही (± 0.01 छ) तौलना. SW-40Ti झूल बाल्टी रोटर और अपकेंद्रित्र में 17 घंटे की एक न्यूनतम के लिए 256.000 x (+३८००० आरपीएम) 4 पर ° छ सी. sucrose gradients के स्थानांतरण दिवस 4: sucrose ढाल भिन्न के संग्रह Centrifugation के 17 घंटे के बाद, अपकेंद्रित्र रन पर रोक कर, और ध्यान से दप – 40Ti रोटर से sucrose gradients हटायें. ध्यान से 70% इथेनॉल के साथ sucrose ढाल ट्यूब के नीचे, पंचर साफट्यूब के एक 21g सुई के साथ नीचे, और बाँझ microfuge ट्यूबों में ढाल से अनुक्रमिक 500 μl भिन्न इकट्ठा. बाद gradients के लिए दोहराएँ. ढाल गुरुत्वाकर्षण प्रवाह द्वारा ड्रिप के लिए अनुमति दी जानी चाहिए, इतनी के रूप में परेशान करने के लिए sucrose ढाल नहीं. हालांकि, अगर टपकता ढाल ट्यूब के नीचे से खत्म होता है, दबाव की एक छोटी राशि एक उंगली का उपयोग ट्यूब के शीर्ष करने के लिए लागू किया जा सकता है. प्रत्येक sucrose के एक refractometer ढाल का उपयोग कर अंश के अपवर्तक सूचकांक का निर्धारण और अपवर्तक सूचकांक छ / 1 मिलीलीटर में एक विशिष्ट घनत्व के साथ सहसंबंधी. एसडीएस पृष्ठ की जुदाई के लिए, nitrocellulose करने के लिए स्थानांतरण, और immunoblotting, प्रतिनिधि sucrose ढाल भिन्न (1.11 से छ मि.ली. / 1.26 ग्राम / मिलीलीटर की 0.01 घनत्व वेतन वृद्धि) की तैयारी करके प्रोटीन स्थानीयकरण का आकलन करें. प्रतिनिधि परिणाम जब सही ढंग से प्रदर्शन किया, दोनों प्रकार से आईएम और ओम vesicles की पूरी जुदाई में इस प्रक्रिया का परिणाम है (SchuS4 जैसे) और प्रकार बी (जैसे LVS) एफ के उपभेदों tularensis. चित्रा 1, एफ में प्रतिनिधि immunoblots में दिखाया गया है tularensis OMPs घनत्व के बीच 1.17 और 1.20 ग्राम / मिलीलीटर का स्थानीयकरण . तुलना करके, IMPs घनत्व के बीच 1.13 और 1.14 ग्राम / मिलीलीटर का स्थानीयकरण. चित्रा 1 एफ के Immunoblotting. tularensis sucrose gradients घनत्व. अनुक्रमिक भिन्न gradients और घनत्व अपवर्तक सूचकांक पर आधारित गणना थे (छ / मिलीलीटर) से एकत्र किए गए थे. प्रोटीन एसडीएस पृष्ठ से अलग हो गए थे, nitrocellulose को हस्तांतरित है, और पता लगाने OMP और छोटा सा भूत fractionation immunoblotted. मेगावाट, आकार (केडीए में) प्रत्येक दाग के बाईं ओर पर नोट के साथ आणविक भार मानकों prestained. LVS, एफ के पूरे सेल lysates tularensis LVS. इसी sucrose ढाल अंश घनत्व उनके संबंधित गलियों से ऊपर उल्लेख किया है. OMPs और IMPs, के रूप में छोड़ दिया मार्जिन में नोट, पॉलीक्लोनल, monospecific antisera के साथ पाया गया. एफ के लिए इसी तरह के परिणाम प्राप्त किया गया SchuS4 tularensis.

Discussion

इस प्रोटोकॉल spheroplasting, आसमाटिक lysis के विभिन्नता है, और sucrose के घनत्व ढाल centrifugation भौतिक जुदाई और अन्य सेलुलर ^{घटकों 2, 3,} 4 से ग्राम नकारात्मक बैक्टीरिया OMS के संवर्धन के लिए सोने के मानक "का वर्णन करता है. जबकि हम पहले दोनों प्रकार से OMS को अलग करने के लिए इस विधि का आवेदन का वर्णन एक और एफ के प्रकार बी उपभेदों ⁵ tularensis, इस प्रस्तुति ओम अलगाव के लिए एक अधिक विस्तृत और अनुकूलित प्रक्रिया प्रदान करता है. दरअसल, यह इस घातक रोगज़नक़ से संभावित सतह उजागर और प्रकल्पित विषैलापन कारकों की पहचान के लिए एक महत्वपूर्ण अग्रिम है. इस प्रक्रिया के महत्व के अध्ययन में हमारे शुद्ध विषमय प्रकार एक एफ के खिलाफ पर्याप्त संरक्षण afforded OMPs के साथ चूहों की कि प्रतिरक्षण दिखा प्रयोगशाला द्वारा प्रदर्शन किया गया tularensis फेफड़े चुनौती ^6. जैसा कि ऊपर उल्लेख किया, बैक्टीरियल कोशिकाओं, आसमाटिक lysis के दौरान सावधान निगरानी, ​​और झिल्ली छर्रों का कोमल resuspension के विकास के चरण महत्वपूर्ण कदम है कि करने के लिए / इस झिल्ली जुदाई प्रक्रिया की सफलता और विफलता के साथ सहसंबंधी प्रकट कर रहे हैं. हालांकि यह अनुकूलित विधि कठोर और कुछ प्रयोगात्मक परिवर्तनशीलता के अधीन है, जिसके परिणामस्वरूप OMS उल्लेखनीय बढ़ाया पवित्रता का हो सकता है के रूप में डिटर्जेंट के उपयोग, लिथियम ^{क्लोराइड, या सोडियम कार्बोनेट 7, 8, 9,} 10, 11 से हुई उन ^की तुलना में दिखाई देते हैं, ^12.

Materials

Material Name	Tipo	Company	Catalogue Number	Comment
Donor calf serum		Mediatech	35-022-CV
IsoVitaleX		Becton Dickinson	211876
Cellgro molecular grade dH2O		Mediatech	46-000-CM
38.5 ml polycarbonate bottle		FiberLite	010-0514
F50L-8×39 ultracentrifuge rotor		FiberLite	096-087051
Complete mini EDTA-free protease inhibitor cocktail		Roche Diagnostics	04693132001
Benzonase		Novagen	70664-3
DC protein assay		BioRad	500-0116
Ultra-Clear 14x95mm centrifuge tubes		Beckman	344060
SW-40Ti swinging bucket rotor		Beckman Coulter	331301
Abbe benchtop refractometer		Fisher Scientific	13-964-10