Inmunoprecipitación de cromatina (CHIP) para el ensayo dinámico de modificación de las histonas en la expresión génica activado en las células humanas
Summary
Este protocolo describe cómo inmunoprecipitación de cromatina (CHIP) se utiliza para estudiar las alteraciones dinámicas de la plantilla de la cromatina que regulan la transcripción inducida por una vía de transducción de señal.
Abstract
En respuesta a una variedad de ligandos extracelulares, el STAT (transductor de señal y activador de la transcripción) factores de transcripción son rápidamente contratados en su estado latente en el citoplasma a los receptores de superficie celular en el que se activan por fosforilación en un único residuo de tirosina 1. A continuación, dímeros y trasladar al núcleo para conducir la transcripción de genes diana, lo que afecta el crecimiento, la diferenciación, la homeostasis y la respuesta inmune. No es de extrañar, dada su amplia participación en los procesos celulares normales, la desregulación de la función STAT contribuye a la enfermedad humana, en particular con el cáncer y enfermedades autoinmunes 2 3.
Está bien establecido que la transcripción está regulada por la alteración de la plantilla de 4,5 cromatina. Estas alteraciones incluyen las actividades de la ATP-dependientes de los complejos, así como covalentes modificaciones de las histonas y la metilación del ADN 6. Debido a la activación de STAT de la expresión génica es a la vez rápido y transitorio, se requiere de mecanismos específicos para la modulación de la plantilla de la cromatina en los loci de genes dependientes de STAT. Para definir estos mecanismos, que caracterizan a la modificaciones de las histonas y la actividad enzimática que los generan en los loci de genes que responden a STAT de señalización. Este protocolo describe inmunoprecipitación de cromatina, un método que es valioso para el estudio de STAT de señalización de la cromatina en la expresión de genes activados.
Protocol
Discussion
El protocolo indica chip se ha utilizado con éxito en el laboratorio de ensayo de más de veinte diferentes modificaciones de las histonas. Además, se han caracterizado los cambios en la ocupación de los factores de transcripción, histonas modificación de enzimas, proteínas que reconocen modificaciones de las histonas y el ARN polimerasa II maquinaria de transcripción, en varios de IFN-γ inducida por los genes. También hemos utilizado el procedimiento para caracterizar los cambios en las modificaciones de las h…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo es apoyado por la Universidad de Virginia, la Universidad de Virginia y el Centro de Cáncer F. Thomas y Kate Miller Jeffress Memorial Trust. Damos las gracias al James E. Darnell Lab (Rockefeller University) Robert Ross Lab (Fordham University) para las líneas celulares.
Materials
| Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| 37% Formaldehyde | Fisher | BP531-500 | ||
| Chloroform/Isoamyl alcohol | Acros | AC32715-5000 | ||
| Complete Mini Protease Inhibitors | Roche | 1836153 | ||
| Cosmic Calf Serum | Hyclone | SH30087.04N | ||
| DMEM | Hyclone | SH30243 | ||
| DTT | Sigma | D0632 | ||
| EDTA | Fisher | BP118-500 | ||
| Ethanol | Pharmco | zp1110EP | ||
| Glycine | Roche | 100149 | ||
| Glycogen | Roche | 901393 | ||
| HEPES | Sigma | H3784 | ||
| IFN-gamma | R&D Systems | 285-IF-100 | ||
| IgG | Jackson Immunoresearch |
109-005-003 |
||
| KCl | MP Biologicals | |||
| LiCl | Sigma | L4408 | ||
| MgCl2 | Sigma | M8266 | ||
| Sodium Acetate | Fisher | BP333-500 | ||
| Deoxycholic Acid Sodium Salt | Fisher | BP349-100 | ||
| NaCl | Fisher | 7647-14-5 | ||
| NP40 | US Biological | N3500 | ||
| Anti-Histone H3, CT, pan | Millipore | 07-690 | ||
| Phenol/chloroform/isoamyl | Fisher | 108-95-2 | ||
| Phosphate Buffered Saline | Fisher | 7647-14-5 | ||
| PMSF | EMD | 50-230-0316 | ||
| Proteinase K | 5-Prime | 2500140 | ||
| RNAse A | 5-Prime | 2500130 | ||
| Salmon Sperm DNA/Protein A Agarose | Millipore | 16-157 | ||
| Salmon Sperm DNA/Protein G Agaorse | Millipore | 16-201 | ||
| SDS | Fisher | BP166-500 | ||
| Tris-Cl | Sigma | T5941 | ||
| Triton X-100 | Acros | 327372500 | ||
| Anti-K36me3 | Abcam | ab9050 | ||
| Anti-STAT1 | Santa Cruz | sc-345X | ||
| Anti-RNA Polymerase II | Santa Cruz | sc-899 |
Referências
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- Campos, E. I., Reinberg, D. Histones: annotating chromatin. Annu Rev Genet. 43, 559-599 (2009).
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