Doku Örnekleri γH2AX Foci kantitasyonu
Summary
ΓH2AX odaklarının dayanarak DNA çift iplikli sonlarının kantitasyonu doku radiosensitivity ve radyasyon değiştirerek bileşikler etkileri değerlendirilmesi için, özellikle radyasyon biyoloji, paha biçilmez bir araç haline gelmiştir. Burada doku örnekleri γH2AX odaklarının kantitatif bir immünofloresan testinin kullanımını göstermek.
Abstract
DNA çift iplikli sonları (DSBs), endojen (fizyolojik veya patolojik) süreçleri veya dışsal faktörler, özellikle iyonlaştırıcı radyasyon ve radiomimetic bileşikleri de ortaya çıkabilir, özellikle ölümcül ve genotoksik lezyonlar vardır. Fosforilasyon serin-139 kalıntı H2A histon varyant, H2AX, son derece korunmuş C-terminal SQEY motifi, γH2AX oluşturan DNA çift iplikli tatili için erken bir cevap.<sup> 1</sup>. Bu fosforilasyon olayı fosfatidil-inosito 3-kinaz (PI3K) proteinleri aile, ataksi telenjiektazi mutasyona uğramış (ATM), DNA-protein kinaz katalitik subunit ve ATM ve RAD3 ilgili aracılık (ATR)<sup> 2</sup>. Genel olarak, ayrık nükleer γH2AX odaklarının oluşumunda DSB indüksiyon sonuçları kolayca algılanır ve immünofloresan mikroskopi tarafından quantitated hangi<sup> 2</sup>. Verilen bu marker benzersiz özgüllük ve duyarlılık, γH2AX odakları analiz, özellikle radyasyon biyolojisi ve nükleer tıp, biyomedikal araştırma uygulamalarında geniş bir yol açmıştır. ΓH2AX odaklarının kantitatif iyonize radyasyon kaynaklı DSBs bağlamda en yaygın olarak hücre kültürü sistemleri araştırılmıştır. Hücresel radiosensitivity dışında, immünofloresan tabanlı testleri de, etkinliğini radyasyon değiştirerek bileşikler değerlendirmek için kullanılır olmuştur. Buna ek olarak, özellikle kanser, γH2AX çeşitli DSB-indükleyici bileşiklerinin etkinliğini incelemek için bir moleküler marker olarak kullanılan ve son zamanlarda önemli bir belirteci olarak yaşlanma ve hastalık habercisi olan<sup> 3</sup>. Ayrıca, immünofloresan tabanlı yöntemler, uygun algılama ve kantitatif γH2AX odakları için adapte edilmiş<em> Ex vivo</em> Ve<em> In vivo</em<sup> 4,5</sup>. Burada, fare dokularda γH2AX odaklarının tespiti ve kantitatif için tipik bir immünofloresan yöntemi göstermektedir.
Protocol
Discussion
Tedavi edilmezse Balb / c farelerinde ve fare akciğer dokusunun kronik allerjik solunum yolları hastalığı bir fare modeli kullanılan bu gösteri amacı için. Biz biraz daha yüksek tedavi edilmezse bölümlerine göre hasarlı akciğer gözlenen ortalamaları ile hücre başına odaklarının sayısındaki farklılıklar quantitated. Özellikle, sırasıyla kantitatif, tedavi edilmezse doku ve kronik alerjik solunum yolları hastalığı doku / hücre başına 6.5 odaklar ve 9.4 odaklar başına / hücre (bölüm…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Avustralya Nükleer Bilimi ve Mühendisliği Enstitüsü destek kabul edilmektedir. TCK AINSE ödül layık görüldü. Epigenomic Tıp Laboratuarı, Ulusal Sağlık ve Tıbbi Araştırma Konseyi (566.559) Avustralya tarafından desteklenmektedir. LM Melbourne Araştırma (University of Melbourne) ve Biyomedikal Görüntüleme CRC ek burs tarafından desteklenmektedir. Monash Micro Görüntüleme desteği (Dr Stephen Cody ve Iska Carmichael), bu iş için çok değerli idi. MMT Ulusal Sağlık Enstitüleri Dr Olga Sedelnikova uzman yardım ve tavsiye için minnettar olduğunu.
Materials
| Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A7906 | BSA (1%) is used to block any non-specific antibody binding. Primary and secondary antibodies are diluted in BSA. | |
| PBS (without Ca2+ and Mg2+) | Invitrogen | 17-517Q | ||
| Optimal Cutting Temperature (OCT) Compound 4583 | Tissue-Tek | 4583 | ||
| Superfrost Plus | Polysine slides | Menzel-Gläser, Germany | SF41296SP | Electrostatically attracts frozen tissue sections and reduces the need for additional coatings and adhesives. |
| Tween 20 | Reagent | Calbiochem | 655205 | Tween 20 (0.5%), is a detergent to permeabilise cells |
| Triton X-100 | Reagent | Sigma-Aldrich | T8787 | Triton X-100 (0.1%) used to permeabilise cells. |
| Paraformaldehyde | Reagent | Sigma-Aldrich | 158127 | |
| Anti-phospho-γH2AX (rabbit polyclonal antibody) | Primary Antibody | Upstate, USA | 07-164 | Dilution of primary antibody (1:500), in 1% BSA. |
| Alexa Fluor 488 goat anti-rabbit IgG (H+L) | Secondary Antibody | Invitrogen | A-11008 | Dilution of secondary antibody (1:500), in 1% BSA. |
| Ethanol (70%) | Thermo Fisher | BSPEL316 | ||
| RNAse A | Reagent | Qiagen | 19101 | |
| Vectashield PI | Reagent | Vector Laboratories | H-1300 | A glycerol based mounting medium containing propidium iodide (a red nuclear stain).This medium must be used with an oil based lense that matches its refractive index. Note: DNA stain commonly used: 4,6-diamidino-2-phenylindole dihydrochloride (DAPI). Can only be used with microscopes with the appropriate excitation laser. |
| Mini PAP Pen | Invitrogen, USA | 008877 | ||
| Coverslips (22x50mm) | Menzel-Gläser, Germany | CS2250100 | ||
| Coplin Jar, glass | Grale Scientific P/L | 1771-OG | ||
| Staining Trough | Grale Scientific P/L | V1991.99 | ||
| Zeiss LSM 510 Meta Confocal | Confocal Microscope | |||
| CM Leica 1950 Cryostat | Leica Microsystems | |||
| Metamorph | Software for Imaging analysis | Molecular Devices, USA |
Referências
- Rogakou, E. P., Boon, C., Redon, C., Bonner, W. M. Megabase chromatin domains involved in DNA double-strand breaks in vivo. J. Cell Biol. 146, 905-916 (1999).
- Bonner, W. M. Gamma H2AX and cancer. Nature Reviews Cancer. 8 (12), 957-967 (2008).
- Dickey, J. S. H2AX: functional roles and potential applications. Chromosoma. 118 (6), 683-692 (2009).
- Bhogal, N. Late residual gamma-H2AX foci in murine skin are dose responsive and predict radiosensitivity in vivo. Radiat Res. 173 (1), 1-9 (2010).
- Redon, C. E., Dickey, J. S., Bonner, W. M., Sedelnikova, O. A. gamma-H2AX as a biomarker of DNA damage induced by ionizing radiation in human peripheral blood lymphocytes and artificial skin. Adv Space Res. 43 (8), 1171-1178 (2009).
- Locke, N. R., Royce, S. G., Wainewright, J. S., Samuel, C. S., Tang, M. L., L, M. Comparison of airway remodeling in acute, subacute, and chronic models of allergic airways disease. Am J Respir Cell Mol Biol. 36 (5), 625-632 (2007).
- Bolte, S. &. a. m. p. ;. a. m. p., Cordelieres, F. P. A guided tour into subcellular colocalization analysis in light microscopy. J Microsc. 224 (Pt 3), 213-232 (2006).
