組織サンプルのγH2AX病巣の定量
Summary
γH2AX巣に基づいてDNA二本鎖切断の定量は、組織の放射線感受性と放射線修正する化合物の作用の評価に、特に放射線の生物学では、非常に貴重なツールとなっています。ここでは、組織サンプルにおけるγH2AX病巣の定量のための免疫蛍光アッセイの使用方法を示しています。
Abstract
DNA二本鎖切断（DSB）は、内因性（生理学的または病理学的）プロセスによって、または外因性の因子、特に電離放射線と放射線作用の化合物のいずれかによって発生する可能性、特に致命的と遺伝毒性病変、です。セリン- 139残基が、高度に保存されたC末端SQEYのモチーフで、γH2AXを形成し、DNA二本鎖切断に早い応答であるにH2Aヒストンバリアント、H2AXのリン酸化<sup> 1</sup>。このリン酸化のイベントは、ホスファチジル – inosito 3 – キナーゼ（PI3K）タンパク質のファミリー、毛細血管拡張性運動失調変異（ATM）、DNA -プロテインキナーゼ触媒サブユニットとATMとRAD3関連によって媒介される（ATR）<sup> 2</sup>。全体的に、離散的な核γH2AX巣の形成におけるDSBの誘導の結果は容易に検出し、免疫蛍光顕微鏡法で定量することができる<sup> 2</sup>。このマーカーのユニークな特異性と感度を考えると、γH2AX巣の分析は、特に、放射線生物学、核医学では、生物医学研究の幅広い用途につながっている。 γH2AX病巣の定量は、最も広く電離放射線誘発DSBがコンテキスト内で細胞培養系で検討されている。離れて細胞放射線感受性から、免疫蛍光ベースのアッセイはまた、放射線改質化合物の有効性を評価するために使用されています。さらに、γH2AXは様々なDSBを誘発する化合物の有効性を検討するための分子マーカーとして使用されており、最近では老化や病気の重要なマーカー、特にがんとして歓迎されている<sup> 3</sup>。さらに、免疫蛍光ベースの方法はγH2AX巣の検出および定量に合うように適応されている<em>生体外で</em>と<em> in vivoで</em<sup> 4,5</sup>。ここで、我々はマウス組織におけるγH2AX巣の検出および定量するための典型的な蛍光抗体法を示しています。
Protocol
Discussion
このデモンストレーションの目的のために我々は、未処理のBalb / cマウスからと慢性アレルギー性気道疾患のマウスモデルからマウスの肺組織を使用する。我々は、未処理のセクションに比べて損傷した肺で観察されたわずかに高い平均で細胞あたりの巣の数の違いを定量。特に、定量はそれぞれ、未処理組織と慢性アレルギー性気道疾患の組織で、/セルあたり6.5巣および/セルあた…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
オーストラリア原子科学技術学会のサポートが認められています。 TCKはAINSE賞を受賞しました。エピ医学研究所は、国立保健オーストラリアの医学研究評議会（566559）でサポートされています。 LMは、メルボルン研究所（メルボルン大学）と医学のCRCの補助金によってサポートされています。モナッシュマイクロイメージング（博士スティーブンコーディとISKAカーマイケル）のサポートは、この仕事のための非常に貴重でした。 MMTは、国立衛生研究所から博士オルガSedelnikovaから専門家の援助とアドバイスに感謝しています。
Materials
| Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A7906 | BSA (1%) is used to block any non-specific antibody binding. Primary and secondary antibodies are diluted in BSA. | |
| PBS (without Ca2+ and Mg2+) | Invitrogen | 17-517Q | ||
| Optimal Cutting Temperature (OCT) Compound 4583 | Tissue-Tek | 4583 | ||
| Superfrost Plus | Polysine slides | Menzel-Gläser, Germany | SF41296SP | Electrostatically attracts frozen tissue sections and reduces the need for additional coatings and adhesives. |
| Tween 20 | Reagent | Calbiochem | 655205 | Tween 20 (0.5%), is a detergent to permeabilise cells |
| Triton X-100 | Reagent | Sigma-Aldrich | T8787 | Triton X-100 (0.1%) used to permeabilise cells. |
| Paraformaldehyde | Reagent | Sigma-Aldrich | 158127 | |
| Anti-phospho-γH2AX (rabbit polyclonal antibody) | Primary Antibody | Upstate, USA | 07-164 | Dilution of primary antibody (1:500), in 1% BSA. |
| Alexa Fluor 488 goat anti-rabbit IgG (H+L) | Secondary Antibody | Invitrogen | A-11008 | Dilution of secondary antibody (1:500), in 1% BSA. |
| Ethanol (70%) | Thermo Fisher | BSPEL316 | ||
| RNAse A | Reagent | Qiagen | 19101 | |
| Vectashield PI | Reagent | Vector Laboratories | H-1300 | A glycerol based mounting medium containing propidium iodide (a red nuclear stain).This medium must be used with an oil based lense that matches its refractive index. Note: DNA stain commonly used: 4,6-diamidino-2-phenylindole dihydrochloride (DAPI). Can only be used with microscopes with the appropriate excitation laser. |
| Mini PAP Pen | Invitrogen, USA | 008877 | ||
| Coverslips (22x50mm) | Menzel-Gläser, Germany | CS2250100 | ||
| Coplin Jar, glass | Grale Scientific P/L | 1771-OG | ||
| Staining Trough | Grale Scientific P/L | V1991.99 | ||
| Zeiss LSM 510 Meta Confocal | Confocal Microscope | |||
| CM Leica 1950 Cryostat | Leica Microsystems | |||
| Metamorph | Software for Imaging analysis | Molecular Devices, USA |
Referências
- Rogakou, E. P., Boon, C., Redon, C., Bonner, W. M. Megabase chromatin domains involved in DNA double-strand breaks in vivo. J. Cell Biol. 146, 905-916 (1999).
- Bonner, W. M. Gamma H2AX and cancer. Nature Reviews Cancer. 8 (12), 957-967 (2008).
- Dickey, J. S. H2AX: functional roles and potential applications. Chromosoma. 118 (6), 683-692 (2009).
- Bhogal, N. Late residual gamma-H2AX foci in murine skin are dose responsive and predict radiosensitivity in vivo. Radiat Res. 173 (1), 1-9 (2010).
- Redon, C. E., Dickey, J. S., Bonner, W. M., Sedelnikova, O. A. gamma-H2AX as a biomarker of DNA damage induced by ionizing radiation in human peripheral blood lymphocytes and artificial skin. Adv Space Res. 43 (8), 1171-1178 (2009).
- Locke, N. R., Royce, S. G., Wainewright, J. S., Samuel, C. S., Tang, M. L., L, M. Comparison of airway remodeling in acute, subacute, and chronic models of allergic airways disease. Am J Respir Cell Mol Biol. 36 (5), 625-632 (2007).
- Bolte, S. &. a. m. p. ;. a. m. p., Cordelieres, F. P. A guided tour into subcellular colocalization analysis in light microscopy. J Microsc. 224 (Pt 3), 213-232 (2006).
