שיטת ה-IP FCM מוצג, המאפשר רגיש, הערכה החזקה, ביוכימיות של חלבונים אינטראקציות הילידים, ללא צורך בהנדסה גנטית או גודל מדגם גדול.
Immunoprecipitation זוהה על ידי cytometry זרימה (IP-FCM) הוא שיטה יעילה לגילוי וכימות חלבונים אינטראקציות. העיקרון הבסיסי משתרע של כריך ELISA, שבה אנליטי העיקרי בשבי ניתן לאתר יחד עם מולקולות אחרות הקשורות פיזית בתוך מתחמי multiprotein. ההליך כרוך צימוד קוולנטי של microbeads לטקס קלקר עם immunoprecipitating נוגדנים חד שבטיים (מב) ספציפיים לחלבון של עניין, דוגרים אלה חרוזים עם lysates תא, חיטוט קומפלקסים חלבונים שנתפסו עם fluorochrome-מצומדות בדיקות, וניתוח חרוז הקשורים הקרינה על ידי cytometry הזרימה. IP-FCM הוא רגיש ביותר, מאפשר ניתוח של חלבונים במצב הטבעי שלהם (לא מפוגל), וכן ניתנת לניתוח או חצי כמותי או כמותי. כפי יתרונות נוספים, IP-FCM לא דורש הנדסה גנטית או ציוד מיוחד, מלבד cytometer זרימה, וזה ניתן להתאים בקלות עבור תפוקה גבוהה יישומים.
מידע על חלבונים אינטראקציות רלוונטי במיוחד בניתוח של תהליכים תאיים רבים כגון התמרה האות, התבגרות השושלת, תא מחזור התקדמות, ומפלים אפופטוזיס. IP-FCM מספק דרך מהירה, כמותית, ורגיש כדי לבחון את האינטראקציה של חלבונים להגדיר חברי מתחמי multiprotein ב קונפורמציה האם שלהם. יכול להיות בשילוב חרוזים ו מודגרות עם lysates תא יום אחד יכול להיות נחקר ונותחו למחרת. תבנית 96, גם צלחת מאפשר מספר גדול של דגימות כדי להיות מנותח בו זמנית כדי לספק יעילות איסוף נתונים למטרות סטטיסטיות או ההקרנה. שימוש בסטנדרטים חרוז ניאון, מספר חלבונים שנתפסו על ידי כל חרוז ניתן להעריך. מקור החומר מעט מאוד צורך ללכוד זיהוי, כך דגימות מוגבל analytes נדיר עדיין יכול להיות מנותח עבור אינטראקציות מרובות. למרות IP-FCM אינו מחייב הנדסה גנטית, epitope תיוג, denaturation, או חוץ גופית ערבוב של חלבונים בסביבה לא פיזיולוגיים, זה יכול להיות יחד עם אלה וטכניקות אחרות, מה שהופך אותו כלי רב ערך ונגיש עם תחולה ל מערכות ביולוגיות רבות.
פתרון בעיות:
רבים IP-FCM ניסויים ליצור אינטראקציה מועילה נתונים חלבון הפעם הראשונה שהם ניסו. עם זאת, אופטימיזציה של FCM-IP יכולה לשפר נטיה נוגדנים חרוזים, ללכוד חלבון מורכב, מחייב בדיקה ניאון.
היעילות של נטיה נוגדן ה-IP ניתן לקבוע על ידי חיטוט בשילוב חרוזים ישירות עם נוגדנים נגד אימונוגלובולינים. אם יעילות זו היא נמוכה, להגדיל את הריכוז של נוגדנים במהלך התגובה צימוד יכולים להרשות נוגדנים IP יותר לצרף כל חרוז. זה יכול להגדיל את קיבולת המחייב של אצווה חרוז IP, וכתוצאה מכך ללכוד זיהוי משופרת של analytes. אחרים ראשוני אמין מולקולות המכילות (למשל טריס, שור אלבומין) לא צריך להיות נוכח במהלך התגובה צימוד, כמו אלה יכולים להתחרות עבור MAB מצורף חרוז לגרום צימוד נמוך מב. אם נטיה של MAB כדי חרוזים מוכיח בעייתית מסיבות אחרות, חרוזים יכול להיות במקום מצמידים את avidin / streptavidin, ונוגדנים biotinylated יכול להיות לאחר מכן לא קוולנטית כבול המשמש immunprecipitation.
למרות נטיה נוגדן טוב, זיהוי ראשוני של הקרינה חרוז הקשורים עלולה להיות נמוכה. לכידת ראשית, מורכב כשלעצמו עשוי להיות נמוך. מכיוון IP-FCM תלויה בריכוז של analytes, להגדיל את מספר התאים lysed לכל יחידת נפח תמוגה יכולים להגדיל ללכוד זיהוי אנליטי ו. בנוסף, ללכוד יכול להיות משופרת על ידי הפחתת מספר חרוזים IP מודגרות עם lysate, אשר מפיצה את מתחמי שנתפסו ברחבי חרוזים פחות, וכתוצאה מכך הקרינה הממוצעת עלתה ל חרוז כאשר נחקר. שנית, יתכן כי גישה של הנוגדן בדיקה של מתחמי שנתפסו מתעכבת sterically על ידי הנוגדן immunoprecipitating. במקרה זה, הבעיה ניתן לטפל באמצעות נוגדנים שונים כדי ללכוד ו / או בדיקה.
עבודה זו נתמכה על ידי הנשרים פרס החדשנות (הוראת אחוות הנשרים) ועל ידי קרן מאיו.
Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
---|---|---|---|---|
carboxylate-modified polystyrene latex (CML) beads (5mm surfactant-free) | Reagent | Interfacial Dynamics Corporation/Molecular Probes | 2-5000 | Store at 4°C. |
Rainbow Calibration Particles | Reagent | Spherotech, Inc. | RCP-30-5A | Store at 4°C. |
2-[N-Morpholino] ethanesulfonic acid (MES) | Reagent | Sigma | M-5287 | |
1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropl) carbodiimide HCl (EDAC) | Reagent | Pierce Sigma |
22980 E-6383 |
Store at -20°C under desiccating conditions. |
Protease Inhibitor General Use Cocktail, containing AEBSF, Bestatin, Aprotinin, EDTA, E-64, and Leupeptin | Reagent | Sigma | P-2714 | Prepare 100x stock solution in H2O. Aliquot and store at -20°C. Handle with gloves. |
PCR plates, 96-well 0.2mL, natural, tall chimney | Reagent | Fisher | 08-408-230 | For use in place of microcentrifuge tubes during FCM staining |