유전 공학 또는 큰 샘플 크기를 요구하지 않고, 고유의 단백질 – 단백질 상호 작용의 구분, 강력하고, 생화학 평가를 허용하는 IP – FCM 방식은 제공됩니다.
유동세포계측법 (IP – FCM)에 의해 감지 Immunoprecipitation은 단백질 – 단백질 상호 작용을 감지하고 quantifying위한 효율적인 방법입니다. 기본 원리는 촬영한 기본 analyte가 실제로 multiprotein의 단지 내에 관련된 다른 분자와 함께 감지할 수했었습니다 샌드위치 엘리사의 그것을 확장합니다. 절차는 관심의 단백질에 대한 단클론 항체 (mAb) 특정을 immunoprecipitating 세포 lysates 이러한 구슬을 잠복기, fluorochrome – 복합 프로브와 함께 캡처 단백질 단지를 프로빙 및 유동세포계측법의 구슬 – 관련 형광을 분석과 폴리스티렌 라텍스 microbeads의 공유 결합 결합을 포함한다. IP – FCM은 매우 민감한 것입니다 자신의 모국어 (비 변성) 상태에서 단백질의 분석이 가능하고, 중 반 정량 또는 정량 분석 의무가 있습니다. 추가 장점으로 IP – FCM은 흐름 cytometer 이외의 유전 공학이나 전문 장비를 필요로하지 않으며 그것은 쉽게 높은 처리량 어플 리케이션에 적용할 수 있습니다.
단백질 – 단백질 상호 작용에 대한 정보는 신호 전달, 가계의 성숙, 세포주기 진행 및 apoptosis의 폭포 많은 세포 프로세스의 분석 관련성이있다. IP – FCM은 단백질의 상호 작용을 검토하고 원시 형태의 multiprotein의 단지의 멤버를 정의하기 위해, 빠른 양적 및 민감한 방법을 제공합니다. 비즈는 결합 및 세포 lysates incubated로 하루에와 탐지하고 그 다음날 분석할 수 있습니다. 96 – 웰 플레이트 형식은 통계 또는 검사 목적을 위해 효율적인 데이터 수집을 제공하기 위해 한 번에 분석하기 위해 샘플을 다수의 허용합니다. 형광 비드 표준을 사용하여 각 비드 점령 단백질의 수를 추정 수 있습니다. 거의 원본 자료는 캡처 및 탐지에 필요한이므로 제한된 샘플 및 부족 analytes은 여전히 여러 상호 작용에 대한 분석을하실 수 있습니다. IP – FCM이 아닌 생리적 환경에서 단백질의 혼합 유전 공학, 에피토프 – 태그, 변성, 또는 – 체외 필요하지 않지만, 그것은 그것에 적용과 가치 및 접근 도구를 만들고, 이들과 다른 기술을 결합 수 있습니다 많은 생물 학적 시스템.
문제 해결 :
대부분의 IP – FCM 실험에 유용 단백질 상호 작용 데이터에게 그들이 시도하는 처음 생성합니다. 그러나, IP – FCM의 최적화 구슬, 단백질 복잡한 캡처 및 바인딩 형광 프로브에 항체 활용을 향상시킬 수 있습니다.
IP 항체 활용의 효율을 방지 면역 글로불린 항체와 직접 결합 구슬을 탐색하여 결정하실 수 있습니다. 이 효율이 낮은 경우, 커플링 반응 중에 항체의 농도를 증가하는 것은 많은 IP 항체가 각각의 구슬에 첨부할 수 있습니다. 이것은 analytes의 향상된 캡처 및 검색의 결과로, IP 비드 배치의 바인딩 용량을 늘릴 수 있습니다. 이러한 낮은 mAb 커플링의 비드 부착 및 결과에 대한 mAb와 경쟁할 수와 같은 다른 기본 – 아민 포함하는 분자 (예 : 트리스, 소 혈청 알부민), 커플링 반응 동안에 존재해서는 안됩니다. 구슬로 mAb의 활용이 다른 이유로 문제가 증명하는 경우, 구슬 대신 아비딘 / streptavidin을 결합 수 있으며, biotinylated 항체는 이후 비 covalently 바운드 및 immunprecipitation 사용할 수 있습니다.
좋은 항체 활용에도 불구하고, 비드 – 관련 형광의 초기 감지는 낮은 수 있습니다. 첫째, 복잡한 촬영 자체가 적을 수 있습니다. IP – FCM은 단위 용해 량 당 lysed 세포의 수를 증가 analytes의 농도에 의존하기 때문에 analyte 캡처 및 감지를 높일 수 있습니다. 또한 캡처는 캡처 이하의 구슬에 걸쳐 단지, 그리고 탐지 비드 당 평균 형광 증가의 결과를 배포 lysate와 함께 incubated IP 구슬의 개수를 줄임으로써 향상된 수 있습니다. 둘째, 그것은 캡처한 단지에 프로브 항체의 액세스가 sterically immunoprecipitating 항체에 의해 방해되어 있습니다. 이 경우에는 문제가 및 / 또는 탐침을 캡처하는 다른 항체를 사용하여 해결할 수 있습니다.
이 작품은 이글스 혁신 수상 (이글스의 성 오더)와 메이요 재단에 의해 지원되었다.
Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
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carboxylate-modified polystyrene latex (CML) beads (5mm surfactant-free) | Reagent | Interfacial Dynamics Corporation/Molecular Probes | 2-5000 | Store at 4°C. |
Rainbow Calibration Particles | Reagent | Spherotech, Inc. | RCP-30-5A | Store at 4°C. |
2-[N-Morpholino] ethanesulfonic acid (MES) | Reagent | Sigma | M-5287 | |
1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropl) carbodiimide HCl (EDAC) | Reagent | Pierce Sigma |
22980 E-6383 |
Store at -20°C under desiccating conditions. |
Protease Inhibitor General Use Cocktail, containing AEBSF, Bestatin, Aprotinin, EDTA, E-64, and Leupeptin | Reagent | Sigma | P-2714 | Prepare 100x stock solution in H2O. Aliquot and store at -20°C. Handle with gloves. |
PCR plates, 96-well 0.2mL, natural, tall chimney | Reagent | Fisher | 08-408-230 | For use in place of microcentrifuge tubes during FCM staining |