Фиксированном объеме или фиксированного давления: мышиной модели геморрагического шока

Summary

Геморрагический модель ударных был надежным и воспроизводимым ресурсом облегчения идентификации и понимания сигнальных каскадов, связанных с воспалением и конечных повреждения органов после травмы. Эта статья предусматривает шаг за шагом, описание хирургических и механические аспекты, связанные с процедурой Геморрагический шок в экспериментальных мышей.

Abstract

Общеизвестно, что тяжелые потери крови и травматического повреждения могут привести к каскаду вредных сигнальных событий часто приводит к смерти. ^{1, 2, 3, 4, 5} Эти сигнальных событий может также привести к сепсису и / или полиорганной недостаточности (MOD ). ^{6, 7, 8, 9} Очень важно, то для расследования причин иммунной функции и вредных сигнальных каскадов с целью разработать более эффективные способы, чтобы помочь пациентам, которые страдают от травм. ¹⁰ Это фиксированная Ударная Геморрагический давления (HS) процедура, хотя технически сложных, является отличным ресурсом для расследования этих патофизиологических условиях. ^{11, 12, 13} Достижения в области оценки биологических систем, т.е. системной биологии позволили научному сообществу для дальнейшего понимания сложный физиологический сетей и сотовой связи моделей ^14. геморрагический шок оказался жизненно важным инструментом для открытия этих клеточных моделей коммуникации как они связаны с иммунной функции. ^{15, 16, 17, 18} Эта процедура может быть освоены! Эта процедура также может быть использован как фиксированный объем или фиксированной подход давления. Мы адаптированы эту технику в мышиной модели активизации исследований в врожденного и адаптивного иммунитета. ^{19, 20, 21} Из-за их небольшого размера УГ у мышей представляет уникальные задачи. Однако из-за множества доступных линий мышей, этот вид представляет беспрецедентный ресурс для изучения биологических реакций. Модель HS является важной моделью для изучения моделей сотовых коммуникаций и ответы систем, таких как гормональные и воспалительные посредника системы и сигналы опасности, то есть сырые и PAMP регуляция как это вызывает различные ответы, которые отличаются от других форм шока. ^{22, 23 , 24, 25} развитие трансгенных мышиных штаммов и индукции биологических агентов для подавления конкретных сигнализации представили ценные возможности для дальнейшего выяснения наше понимание вверх и вниз по регулированию передачи сигнала после тяжелой потери крови, то есть ГС и травмы ^{26, 27 , 28, 29, 30.}

Есть множество методов реанимации (R) в сотрудничестве с СС и травмы. ^{31, 32, 33, 34} фиксированных метод реанимации объеме исключительно лактата Рингера (LR), равную в три раза объем крови пролил, используется в этой модели для изучения эндогенных механизмов, таких как дистанционное повреждения органов и системного воспаления. ^{35, 36, 38} Такой способ реанимации доказали свою эффективность в оценке последствий и травмы HS ^{38, 39.}

Protocol

1. Инструмент и Хирургическая подготовка поля: 1. Подготовка инструментов. Все хирургические процедуры выполняются с использованием асептических методов. Хирургических синий блокнот и стерильную повязку поля используются. Все материалы и инструменты стерилизуются перед использованием. 6-0 швов, аппликаторы хлопка наконечником, марля, между мужчинами, 3-полосная запорные краны, и инструменты автоклава стерилизацию. Преобразователи, ПЭ-50 и ПЭ-10 трубки являются окись этилена стерилизовать. Все 3-полосная запорные краны, шприцы и иглы получили стерильные. 6-0 Шовный разрезается на 1-дюймовые части (6 шт / животное) и положить в маленькие мешочки стерилизации. Хлопок-наконечник аппликаторы, квадраты 4×4 марли, и между мужчинами, 3-полосная кранами помещаются в любом малого или среднего мешочки стерилизации и автоклавировать. Наши хирургические инструменты автоклаве стерилизовать каждый вечер. Они моют после операции с применением антибактериального мыла и водопроводной воды. Им разрешается сушить на чистую хирургических синие панели. Затем они осторожно положил в карман стерилизации и стерилизовать для использования на следующий день. Так как датчики и трубы имеют пластиковые детали, они должны быть стерилизованы использованием газа, т. е. окиси этилена. ПЭ-10 трубки разрезают на 5-дюймовые части и помещают в мешочек стерилизации. ПЭ-50 трубка разрезается на 18-дюймовые части и помещают в мешочек среду стерилизации. 2. Хирургическое поле. Для настройки операционного поля, во-первых, включите горячий шарик стерилизатор для обеспечения он достигает соответствующей температуры 300-350 ° F до начала операции. Затем переходите к следующим шагам, поставив хирургических синие колодки вниз на алкоголь вытер настольный. Один площадке идет под микроскопом и других продолжается циркулирующих грелку, где ВР анализаторы расположены. Место стерильной перевязочного над обоими хирургических синие колодки. Заполните лоток из нержавеющей стали инструментом 1 / 3 часть пути с 70% спиртом. Используйте достаточно 70% этанола, чтобы охватить все хирургические инструменты. Используйте отдельную стерильную повязку поля и поместить его рядом с микроскопом. Поместите все стерильные инструменты, шовные, марля, и катетеры на этом стерильном поле. Будьте осторожны при открытии стерильные инструменты и шовный не загрязнять их, прикасаясь к ним. Лучше всего использовать стерильные перчатки при этом процедуру установки. 2. Механическая настройка и процедур: 1. Катетер Настройка. Для настройки правую ногу мышиной катетер для измерения АД, во-первых, надел стерильные перчатки. Тогда получить стерильные ПЭ-10 трубки из автоклавного сумке. Захватите середину трубки пальцем и большим пальцем указателя оставив около дюйма между ними. Стретч этом разделе трубки немного, чтобы сделать его тоньше в диаметре, чтобы помочь с катетера. После растяжения трубки резать пополам использованием стерильных ножниц. 5-дюймовый трубопровод должен теперь быть две части примерно 2 с половиной дюймов в длину. Убедитесь в том, конические растягивается конца. * НЕ угол скошенным краем слишком много, поскольку это может увеличить шансы на выход из просвета роется нижней стенки сосуда. Вставьте 30G иглу в тупой нерастянутое конце трубки. Получить стерильный шприц и 1cc 3-ходовой кран. Использование алкоголя протрите для стерилизации начало 10cc стерильной флакон, содержащий гепарин физиологическим раствором (0,1 мл Heparin/9.9ml Saline). Заполните шприц с 0,6-0.7cc из раствора гепарина. Прикрепить иглы 30G и катетер до конца 3-пути, который прямо через дорогу от мужской конец. Заполните кран, 30G иглу, и ПЭ-10 трубки с гепарином решение. Убедитесь в том, чтобы все пузырьки воздуха из системы. Наиболее эффективным способом, чтобы удалить все пузырьки воздуха является использование силы тяжести. Направьте иглу к земле, а дать трубку болтаться в настольный. Дайте иглой центр щелчком пальцев и пузырьки всплывают на верхней части раствора гепарина. Удалить 30G иглу из 3-х и удалить пузырьки. Вывод жидкости в 3-путь назад в 1cc шприц для удаления пузырей, которые оказались в ловушке в 3-х и прикрепить трубку к 3-полосная. Примерно 1cc смеси должно оставаться в шприц. Мышь получит около 0.05cc этой смеси (в результате промывки катетера для поддержания проходимости при вставке) равное примерно 1U гепарином / мышь. Поместите этот завершена катетер на стерильной перевязочного с хирургическими инструментами. Для настройки левую ногу мышиной катетер следовать той же процедуре, как описано выше, за исключением 3-х ходовой кран. Левая нога используется для рисования крови и 3-полосные крана не требуется. Заполните другой стерильной 1cc шприц с 0,15-0.2cc из гепаринизированной солевой смеси. Подключите иглы 30G и ПЭ-10 Tubiнг непосредственно 1cc шприц. Заполните эту левая система катетер ногу с решением. Удалить пузырьки из этой системы, тоже. Место завершена катетер на стерильном поле повязка с стерильные инструменты. 2. Преобразователь Настройка. Подключите датчик к стерильным Digi-мед BPA 400 анализатор в соответствии с микро-мед спецификаций. Прикрепить 3-полосная кран к обоим концам преобразователя. Заполните 10cc шприц с раствором Рингера лактата (LR) и приложите его к 3-полосная так преобразователь будет лежать на настольный. Вставьте 23G иглу в оба конца кусок нарезанные presterilized 18-дюймов ПЭ-50 трубок. Подключите один конец PE-50 трубки к 3-полосная с 10cc шприц прилагается. Заполните 3-полосные и ПЭ-50 установки с LR. Убедитесь в том, чтобы все пузырьки воздуха из системы, как описано в предыдущем разделе. Снова 3-полосная с датчиком и заполнить датчика и 2-й 3-полосная с LR. Наконец, придают металлический мужчинами Leur блокировки кран для 23G иглу ПЭ-50 трубки для крепления к правой ноге мышиной катетер. * Очень важно, чтобы жидкость остается в датчик во время работы. * Следуйте калибровки и нулевых процедур в соответствии с Micro-мед протокола. 3. Хирургическое и экспериментальной процедуры: 1. Хирургических процедур. Начните путем введения при введении препарата в Pentobarbitol натрия (Nembutol) (70mg/kg @ 1:10 разведение). Эта процедура осуществляется, во-первых, выбирая мышь вверх из клетки с помощью базового (наиболее проксимального конца) его хвост. Далее, поместите животное в верхней части клетки, продолжая удерживать ее хвост. Захватите шее загривок мыши с большим и средним пальцами по обе стороны от мыши сразу за передними лапами. Указательный палец используется для потяните кожу на голове / шее регион обратно к загривок, чтобы обездвижить голову. Хвоста мыши, затем упаковывается и состоявшийся между мизинцем и безымянным пальцем в то время как безымянный палец вдавливается в поясничном отделе позвоночника мыши. Мыши должны спать в течение 5 минут. После наркоза животное поместить их на металлическую пластину хирургическое в положении лежа. Свободную технику ленты цикл используется для обездвиживания животных лентой их конечностей. Свободную технику цикла влечет за собой просто резки тонких полос ленты и упаковки ленты свободно вокруг каждого из передних конечностей ниже лапой и вокруг каждого из задних конечностей уступает лапу. Лента то застрял обратно к себе и оставшиеся ленты крепится к доске. Это позволяет конечностей мышей предположить более естественным анатомическом положении. Брюшных и паховых областях животного затем бритая использованием Остер A5 клиперов размер 40 лезвие. Марли 4х4 облили бетадин и хирургической области, затем вытер на стерильность. После блокировки и стерилизации, носовой обтекатель с 1cc изофлюрана находится над носом мыши на несколько секунд, прежде чем первоначальный разрез. Носового конуса состоит из 50cc конической трубки, заполненной марлю. Половина нижней части трубки вырезают создание пространства для носа мыши на отдых внутри без контакта. Колпачок (нижней части контейнера хранения ткани) помещается в конец 50 см конический для обеспечения изофлуран паров не убежать. Как только дыхание животного начинают медленно, небольшой 4-5мм надрез в коже параллельно левой внутренней косой мышцы живота и левого поперечных мышц брюшной. Препарирование бедренную вену и артерию следующим образом. Убедитесь в том, чтобы не повредить окружающие мышцы или касаться нервов. Чтобы начать этот рассечение, отдельные жировой ткани косые и поперечные мышцы живота, захватывая жировой ткани с dumonts в брюшной соединения. Вытяните этой ткани от мышц стенки. Затем тупым рассекают вдоль мышц живота дразнить от фасции и жировой ткани с помощью другой пары dumonts. Просто под этим жировой ткани лежат бедренной вены и артерии, а также бедренного нерва. * Убедитесь, чтобы не повредить vastus intermedius, медиальной и латеральной мышц четырехглавой мышцы бедра или прямая мышца бедра. Существует действительно нет необходимости, чтобы захватить или даже прикасаться к этим мышцам. * НЕ ТРОГАТЬ бедренного нерва Рассеките от нервов, захватывая жировой ткани, которая лежит рядом с ним. Вытяните этой ткани латерально от вены и артерии и нервы будут следить, как он встроен в этой ткани. Как нерв натягивается сбоку, тупая рассекают фасцию путем размещения других dumonts пункт вниз, от сердца и открывать и закрывать их. Судов очень поверхностны так что будьте уверены, что некопаться в нижние мышцы. После нерв отделяется, используйте dumonts отделить фасции проведения судов к мышцам. Держите закрытыми dumonts и скольжения dumonts дорсальнее судов. Как кончик dumonts появляется на другой стороне вены, открыть их, чтобы притупить рассекают фасцию. Держите dumonts спинной на судно и захватить первый шов. Положить швом на dumonts и тянуть шов обратно через отверстие между сосудами и подлежащие мышцы. Опять же, нет никакой необходимости, чтобы повредить окружающие мышцы. Положите в общей сложности 3, 6-0 швами вокруг вены и артерии. Шовный 1 является самым проксимальнее мышцы живота. Свяжите узел, но оставить его свободным и кровоостанавливающего его. Вогнутый край кровоостанавливающего стоит почивать на брюшную полость животного. Шовный 2 является самой дистальной в месте. Этот шов может быть привязана немедленно лигирования сосудов и hemostated, опять же вогнутой стороной вниз. Дистальных и проксимальных швы используются для извлечения судов тугой (для предотвращения потери крови) и поднять их немного, чтобы помочь в катетера. Шовный 3 шва катетер поддержки. Поместите этот шов между дистальной и проксимальной швов. Галстук свободно узел, который будет использоваться для обеспечения катетером внутри сосуда после введения. После швы находятся в безопасности, определить артерии с помощью толстой стенкой сосуда. Это очень белый. Сделайте небольшой надрез в верхней части артерии использованием microscissors. Сделать это отверстие рядом с дистальным швом так что есть достаточное количество артерии для первоначального введения катетера. Используйте dumonts, чтобы открыть отверстие, поместив один конец dumonts в просвет артериальных сосудов и закрытие их на стенки сосуда. Будьте уверены, средний шов проксимальнее артериальной отверстие, чтобы он мог быть использован для хранения катетер на месте после первого введения. Удерживая артериальной стенки толчок катетер в полость, потянув за судно катетер. Слегка сковать средний шов поддержки провести катетер на месте. Выпуск проксимальных кровоостанавливающего. Этот релиз будет ослабить проксимального шва и снова шва вокруг сосудов. На данный момент, артериального давления необходимо нажать кровь обратно в катетер. Пульсирующая кровь должна быть видна в катетер. Держите сосуды вокруг катетера с одним Дюмон и использовать другие подтолкнуть катетер в сосуд около 4-5мм. Холдинг судна вокруг катетера помогает предотвратить разрыв артерии. Кончике катетера должна лежать прямо под внутренней косой и поперечной мышц брюшной. Для предотвращения тромбов в артериальной линии, снять крови в катетер и толкать ее обратно в мышь несколько раз вдохнуть гепаринизированной жидкости. Повторите эту процедуру для другой ноги для двусторонней катетеризации бедренной артерии. Хук животных до физиологических параметров монитора, т.е. бисфенола-400 анализатор и промойте артериальной линии. Положите 1 или 2 капли стерильного физиологического раствора в хирургическое открытие сохранить окружающую ткань влажной. Будьте уверены, чтобы сохранить эту область насыщения на протяжении всей процедуры. Место стерильной перевязочного над животным на протяжении всей процедуры, чтобы помочь сохранить стерильность. Место хирургические инструменты в 70% спирте и протрите их стерильной марлей. Поместите их в горячий шарик стерилизатор для ~ 20 секунд для стерилизации между животными. Удалить хирургических инструментов и брызги их с 70% спиртом, чтобы помочь им остыть. Разместите их на стерильной клавиатуры. Убедитесь, что нет никакого алкоголя осталось на инструменты, которые будут капать обратно в следующем животных. 2. Геморрагического шока. За 15 мин. сроки, примерно 1 / 2 объема крови мыши изымается достижения среднее артериальное давление 28-32мм рт. * Для 25-27г мыши первоначального объема крови сняты для достижения желаемого давления примерно 0.6cc Эта процедура метод фиксированного давления, в отличие от фиксированного объема. Эти процедуры могут, однако следует придерживаться при фиксированных давлении и фиксированной кровоизлияния объемом. Будучи последовательно контролироваться, животное останется в геморрагическим шоком для 1,5-3 часа. Как животное пытается компенсировать и среднее артериальное давление начинает повышаться снова незначительно (видимый через ВР / HR анализатор) снять больше крови для достижения желаемого давления. Хотя добавки (0.05cc Nembutol IP), которые очень редко используется во время процедуры HS, животных дыхания, движения усов, рефлекторные тесты, а также цифровой BP / HR чтение поможет определить, когда животное нуждается в дополнении анестезии. Животные находятся под лампой и на циркулирующие грелку, чтобы помочь поддерживать температуру 36-37 ° С через Геморрагический процедуры Shock. Температура проверяется с помощью ректального датчика. 3. Реанимация. После шока время elapsэс, животное реанимации (R) с использованием лактата Рингера (LR) раствора при фиксированном объеме 3-кратный объем пролитой крови каждого животного. Объем LR вводят через шприц насос установлен обойтись, с постоянной скоростью, объемом более 15 минут. интервал. Удаление катетера и перевязывать судов, использующих 3 швов. Вытяните катетер только мимо проксимального шва и увязать это шов полностью выключен. Это позволит предотвратить любые потери крови. Обеспечение потока предотвращает задние конечности стать ишемический. 4. Сообщение Rescitation. После R обе задние конечности отверстия зашиты использованием стерильных 4-0 шва PDSII. Свободные ленты петля снимается и животных помещают в чистую клетку, которая хранится на циркулирующие грелку в течение нескольких часов после восстановления. Болеутоляющие должны быть введены в виде животных начинают пробуждаться от анестезии, чтобы правильно управлять болью. Бупренорфин (0.1mg/kg) вводится подкожно, как животные начинают физической активности, но не раньше, чтобы не идти на компромисс дыхательной функции. Использование агрессивных мониторинга оперативной пост оправдано IACUC утвержденного протокола, индивидуальное поведение животных, и текущие заболевания рекомендуется. 4. Секреты успеха: При вскрытии сосудов, будьте уверены, не трогать бедренного нерва Будьте уверены, чтобы не повредить прямая мышца бедра, прямая латеральной и медиальной vastus мышц. Существует действительно нет необходимости, чтобы захватить или даже прикасаться к этим мышцам. Не делайте угол скоса катетер слишком резким, как это приведет к катетер выхода просвет и неконтролируемые кровотечения Убедитесь в том, чтобы принять дополнительные усилия, чтобы оставаться максимальную стерильность. Убедитесь Есть нет воздушных пузырьков в любом из катетера или датчик системы. Удостоверьтесь, чтобы иметь LR жидкости в преобразователь пока он находится в эксплуатации. Сухого хода может привести к повреждению системы ВР. Сделать артериальной отверстие невелико. Сделать артериальной отверстие рядом с дистальным швом. Нажмите катетер одновременно потянув судна над ним катетера, чтобы избежать копирования артерии. Не забудьте сохранить хирургические отверстия в ногах насыщенных стерильным физиологическим раствором, чтобы предотвратить неконтролируемое повреждение тканей или потери жидкости. Терпение и тонкостью являются критическими. Обратите особое внимание на физиологии животных в течение всего эксперимента. 5. Послеоперационные проблемы: Проверьте ишемии в ногу. Хотя залога поток должен не допустить этого. Животное могло бы проблемы с использованием задних конечностей в результате хирургических манипуляций и связанных с воспалением. Управление болью соответствующим образом. Прикосновение и впоследствии повреждения нерва может привести к неспособности животных к мобилизации.

Materials

Instrument	Manufacturer	Catalogue Number
Dumonts(SS/45° angle 0.2×0.12mm-tip, 13.5cm length)	Fine Science Tools	11203-25
Surgical scissors (straight-12cm)	Fine Science Tools	14068-12
Hemostats (curved-12.5cm)	Fine Science Tools	13009-12
Microscissors (spring scissors- straight-8cm)	Fine Science Tools	15000-00
Forceps (0.8mm-tip, curved-10cm)	Fine Science Tools	11050-10
suture reel 6-0	Fine Science Tools	18020-60
suture 4-0 PDSII	Penn Vet	ETHZ304H
gauze 4×4	can be purchased through any global vendor
cotton-tip applicator	can be purchased through any global vendor
30G needle	can be purchased through any global vendor
23G needle	can be purchased through any global vendor
3cc syringe	can be purchased through any global vendor
5cc syringe	can be purchased through any global vendor
10cc syringe	can be purchased through any global vendor
50cc conical tube	can be purchased through any global vendor
1cc syringe w/ 25G needle	Fisher Scientific	14-826-88
Polyethylene 10 tubing 100` (PE-10)	Fisher Scientific	14-170-12P
Polyethylene 50 tubing 100` (PE-50)	Fisher Scientific	14-170-12B
3-way stopcock	Fisher Scientific	NC9779127
surgical blue pad	Fisher Scientific	50-7105
Sterile Field dressings	Fisher Scientific	NC9517505
tape rolls 1″	Corporate Express	MMM26001
straight side wide mouth jars (used as cap for nose cone)	VWR	159000-058
stainless steel tray 8″ x 11″	VWR	62687-049
male-male leur lock 3-way	VWR	20068-909
sterilization pouch 3″x8″	VWR	24008
sterilization pouch 5″x10″	VWR	24010
Wild M650 microscope w/ boom stand	Leica
Leica IC D digital camera/live image	Leica
Digi-Med BPA-400 analyzer & systems integrator	Micro-Med	SYS-400
TXD-310 (Digi-Med Transducer)	Micro-Med	TXD-300
Computer	Dell
Hot bead instrument sterilizer	VWR	18000-45
Oster A5 clippers w. size 40 blade	VWR	10749-020
circulating heating pad 18×26	Harvard	py872-5272
rectal thermometer	Kent Scientific	RET-3

Reagent	Concentration	Manufacturer	Catalogue Number
Pentobarbital Sodium (Nembutol Sodium Solution)	70mg/kg	Ovation
Buprenorphine HCl	0.1mg/kg	Bedford Laboratories
Lactated Ringers Injection 250cc IV bag	Baxter
Aerrane (Isoflurane)	99.9%	NLS Animal Health	105996
Heparin Sodium	1000U	Abraxis
Bacteriostatic Sodium Chloride	0.9%	Hospira
Ethyl Alcohol	70%	Pharmaco-AAPER
Triadine Povidone Iodine (Betadine)		Triad disposables