Transurethrale Inductie van Mouse urineweginfectie
Summary
Deze video zal aantonen methoden om transurethrally veroorzaken muis infecties van de urinewegen en kwantificeren van de omvang van de resulterende infecties.
Abstract
Uropathogene bacteriestammen die van belang zijn gekweekt op agar. In het algemeen, uropathogene<em> E. coli</em> (UPEC) en andere stammen kunnen 's nachts worden geteeld op Luria-Bertani (LB) agar bij 37 ° C in de lucht. UPEC stammen groeien als geel-wit doorschijnende kolonies op LB agar. Na de bevestiging van de juiste kolonie morfologie, zijn enkele kolonies vervolgens opgepikt te worden gekweekt in bouillon. LB bouillon kan gebruikt worden voor de meeste uropathogene bacteriestammen. Twee seriële, 's nachts LB bouillon culturen kan worden gebruikt om de expressie van type I pili, een goed gedefinieerde virulentie factor voor uropathogene bacteriën te verbeteren. Bouillon culturen zijn verdund tot de gewenste concentratie in fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS). Acht tot 12 weken oude vrouwelijke muizen zijn geplaatst onder isofluraan anesthesie en transurethrally geënt met bacteriën met behulp van polyethyleen buizen bedekt met 30 gauge spuiten. Typische inocula, die empirisch moeten worden bepaald voor elke bacteriële / muizenstam combinatie, zijn 10<sup> 6</sup> Tot 10<sup> 8</sup> Kve per muis in 10 tot 50 microliter van PBS. Na de gewenste infectie periode (een dag tot enkele weken), urine monsters en de blaas en de beide nieren worden geoogst. Elk orgaan is gehakt, geplaatst in PBS, en gehomogeniseerd in een Blue Bullet homogenisator. Urine en weefsel homogenaten zijn serieel verdund in PBS en gekweekt op juiste agar. De volgende dag, zijn kolonievormende eenheden geteld.
Protocol
Discussion
Inductie van de muis urineweginfectie door transurethrale inoculatie van bacteriën is een reeds lang bestaande, maar technisch veeleisende procedure 11. Hung en Hultgren publiceerde onlangs een uitstekend overzicht van transurethrale technieken van de muis urineweginfectie 13. In dit artikel proberen we verder te illustreren de finesses van deze experimentele aanpak.
Beginners kunnen oefenen hun techniek door het uitvoeren van een midline laparotomie om de blaas bloot …
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
De auteurs willen graag Shelly Xie en Jennifer Payne erkennen voor hun deskundige technische bijstand. Dit werk werd mogelijk gemaakt door subsidies van de Society of Pediatric Urologie en de Stanford Pediatric Research Fund.
Materials
| Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Cryovial tubes, 2.0 ml polypropylene (no caps) | E&K Scientific | 640201 | ||
| Caps for cryovial tubes, with ‘O’ ring | E&K Scientific | 440011-N | ||
| Bullet Blender | Next Advance | BBX24 | ||
| Zirconium Oxide Beads (0.5mm) | Next Advance | ZROB05 | ||
| Stainless Steel Beads (1.6mm) | Next Advance | SSB16 | ||
| Stainless Steel Bead Blend (0.9-2.0mm) | Next Advance | SSB14B | ||
| CBA/J Mice, 8-12 week old female | Jackson Laboratories | 000656 | ||
| Phosphate Buffered Saline (NaCl 137mM, KCl 2.7mM, Na2HPO4 4.3mM, KH2PO4 1.4mM) | EMD | EM-SX0420-13 (NaCl) EM-PX1405-1 (KCl) EM1.06585.0 (Na2HPO4) EM-5108-1 (KH2PO4) | ||
| LB agar | ||||
| LB broth | EMD | 1.10285.0500 | ||
| Isoflurane (Aerrane) | Baxter | NDC 10019-773-60 | ||
| Inoculating loops | Fisher Scientific | 22-363-601 | ||
| Eosin-methylene blue (EMB) agar powder | Himedia Laboratories | MM022-500G | ||
| MacConkey agar powder | Difco | 212123 | ||
| LB agar powder | Difco | 244520 | ||
| Intramedic non-radiopaque polyethylene tubing, PE10 [inner dimension 0.28 mm (0.011 inch); outer dimension 0.61 mm (0.024 inch)] | BD Biosciences | 427401 | ||
| 30 gauge needles, 1/2 inch | BD Biosciences | 305106 | ||
| 1 ml tuberculin Slip-Tip syringe | BD Biosciences | 309602 | ||
| 3 ml Luer-Lock syringe | BD Biosciences | 309585 |
Referências
- Schaeffer, A. J., Schwan, W. R., Hultgren, S. J., Duncan, J. L. Relationship of type 1 pilus expression in Escherichia coli to ascending urinary tract infections in mice. Infect Immun. 55, 373-380 (1987).
- Rouschop, K. M. Urothelial CD44 facilitates Escherichia coli infection of the murine urinary tract. J Immunol. 177, 7225-7232 (2006).
- Malaviya, R., Ikeda, T., Abraham, S. N. Contribution of mast cells to bacterial clearance and their proliferation during experimental cystitis induced by type 1 fimbriated E. coli. Immunol LettM. 91, 103-111 (2004).
- Lane, M. C., Alteri, C. J., Smith, S. N., Mobley, H. L. Expression of flagella is coincident with uropathogenic Escherichia coli ascension to the upper urinary tract. Proc Natl Acad Sci U S A. 104, 16669-16674 (2007).
- Hvidberg, H. Development of a long-term ascending urinary tract infection mouse model for antibiotic treatment studies. Antimicrob Agents Chemother. 44, 156-163 (2000).
- Hopkins, W. J., Hall, J. A., Conway, B. P., Uehling, D. T. Induction of urinary tract infection by intraurethral inoculation with Escherichia coli: refining the murine model. J Infect Dis. 171, 462-465 (1995).
- Hopkins, W. J., Gendron-Fitzpatrick, A., Balish, E., Uehling, D. T. Time course and host responses to Escherichia coli urinary tract infection in genetically distinct mouse strains. Infect Immun. 66, 2798-2802 (1998).
- Gunther, N. W. t., Lockatell, V., Johnson, D. E., Mobley, H. L. In vivo dynamics of type 1 fimbria regulation in uropathogenic Escherichia coli during experimental urinary tract infection. Infect Immun. 69, 2838-2846 (2001).
- Bishop, B. L. Cyclic AMP-regulated exocytosis of Escherichia coli from infected bladder epithelial cells. Nat Med. 13, 625-630 (2007).
- Thumbikat, P., Waltenbaugh, C., Schaeffer, A. J., Klumpp, D. J. Antigen-specific responses accelerate bacterial clearance in the bladder. J Immunol. 176, 3080-3086 (2006).
- Hagberg, L. Ascending, unobstructed urinary tract infection in mice caused by pyelonephritogenic Escherichia coli of human origin. Infect Immun. 40, 273-283 (1983).
- Hopkins, W. J., Hall, J. A., Conway, B. P., Uehling, D. T. Induction of urinary tract infection by intraurethral inoculation with Escherichia coli: refining the murine model. J Infect Dis. 171, 462-465 (1995).
- Hung, C. S., Dodson, K. W., Hultgren, S. J. A murine model of urinary tract infection. Nat Protoc. 4, 1230-1243 (2009).
