Questo lavoro si propone di istruire il lettore al funzionamento di un sistema integrato di forza atomica-microscopio ottico di imaging per la stimolazione meccanica delle cellule vive nella cultura. Un passo-passo il protocollo viene presentato. Un insieme rappresentativo di dati che mostra dal vivo risposta alla stimolazione meccanica delle cellule è presentato.
Per capire il meccanismo con cui le cellule viventi senso forze meccaniche, e come rispondono e si adattano al loro ambiente, una nuova tecnologia in grado di studiare il comportamento delle cellule a livello sub-cellulare di livello ad alta risoluzione spaziale e temporale è stato sviluppato. Così, un microscopio a forza atomica (AFM) è stato integrato con la riflessione interna totale fluorescenza (TIRF) microscopia e in rapida rotazione del disco (FSD) microscopia confocale. Il sistema integrato è ampiamente applicabile per una vasta gamma di studi di dinamica molecolare in alcun cellule aderenti vivere, permettendo diretta imaging ottico delle risposte delle cellule alla stimolazione meccanica in tempo reale. Riorganizzazione significativa dei filamenti di actina e adesioni focali è stato dimostrato a causa di locali stimolazione meccanica sulla superficie cellulare apicale che hanno indotto cambiamenti nella struttura cellulare in tutto il corpo cellulare. Queste tecniche innovative forniranno nuove informazioni per comprendere la ristrutturazione delle cellule vive e dinamiche in risposta alla forza meccanica. Un protocollo dettagliato ed un set di dati rappresentativi che la risposta delle cellule spettacolo dal vivo allo stimolo meccanico sono presentati.
Aderenze citoscheletro 7-10 e 11-16 focali sono strutture dinamiche che assemblano, si disperdono e girare come le cellule migrano o rispondere a forza meccanica 17. Essi hanno funzioni importanti nella regolazione della crescita cellulare, la sopravvivenza, e l'espressione genica. Conoscendo la loro distribuzione e le dinamiche specifiche fornisce una migliore comprensione di come le cellule comunicano con la matrice e tra loro.
Questo sistema nuovo micr…
The authors have nothing to disclose.
Plasmide vinculina-GFP è stato un dono di Kenneth Yamada, National Institutes of Health, National Institute of Dental Research e craniofacciale, Bethesda, Maryland, e actina-MRFP plasmide era un dono di Michael Davidson, Florida State University, Tallahassee, in Florida.
Questo lavoro è stato sostenuto dal premio alla carriera NSF # 0747334 e AHA-Nazionale SDG # 0835205N di Andreea Trache.
Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
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AFM tip | Novascan Technologies | 2 micron Borosilicate bead, 0.01N/m, Biotin Surface | ||
avidin | Sigma Aldrich | A9275 | 1mg/mL in DPBS | |
Fibronectin | Sigma Aldrich | F4759 | 1 mg/mL | |
DPBS | Invitrogen | 21600-051 | ||
Amaxa transfection kit for Smooth Muscle Cells | Lonza | VPI-1004 | ||
Mattek glass bottom dishes | MatTek Corporation | P60G-1.5-30-F | Sterile 60mm Falcon dishes with glass bottom coverslip no. 1.5 |