Identifizieren Dysregulated Gene von Kaposi-Sarkom-assoziierten Herpesvirus (KSHV) Induced
Summary
Wirtszelle Faktoren spielen eine entscheidende Rolle bei der Errichtung und Wartung von Kaposi-Sarkom (KS). Wir skizzieren Methoden zur Wirtszelle Faktoren in KSHV-infizierten DMVEC Zellen verändert zu identifizieren und in KS Tumorgewebe. Zellulären Genen durch Viren verändert wird als potenzielles Ziel (e) für neuartige Therapeutika dienen.
Abstract
Derzeit KS ist die vorherrschende HIV / AIDS-Malignome im südlichen Afrika und damit die Welt. 1,2 Es wird als angioproliferative Tumor des vaskulären endothelialen Zellen charakterisiert und produziert seltenen B-Zell-lymphoproliferativen Erkrankungen in Form von Pleuraerguss Lymphome (PEL) und einige Formen der multizentrischen Castleman-Krankheit. 3-5 Nur 1-5% der Zellen in KS-Läsionen aktiv unterstützen lytischen Replikation des Kaposi-Sarkoms-assoziierten Herpesvirus (KSHV), die als Erreger mit KS verbunden, und es ist klar, dass zelluläre Faktoren müssen Interaktion mit viralen Faktoren in den Prozess der Onkogenese und Tumorprogression. 6,7 Identifizierung neuartiger Host-Faktor Determinanten, die KS Pathologie beitragen wird für die Entwicklung prognostischer Marker für Tumorprogression und Metastasierung sowie bei der Entwicklung neuartiger Therapeutika zur Behandlung von KS wesentliche . 8 Das dazugehörige Video Details der Methoden, die wir verwenden, um Wirtszelle Genexpression Programme in dermalen mikrovaskulären Endothelzellen (DMVEC) nach KSHV Infektion und in KS Tumorgewebe verändert zu identifizieren. 9 Sobald dysregulierten Gene durch Microarray-Analyse identifiziert werden, sind Veränderungen in der Proteinexpression bestätigt durch Immunoblot-und Dual gekennzeichnet Immunfluoreszenz. Änderungen in transkriptionelle Expression von dysregulierten Gene sind in vitro durch quantitative real-time Polymerase-Kettenreaktion (qRT-PCR) bestätigt. Validierung von in vitro-Ergebnisse mit Hilfe von Archivierungs KS Tumorgewebe wird auch durch dual bezeichnet Immunchemie und Tissue Microarrays durchgeführt. 8,10 Unser Ansatz zur Identifizierung dysregulierten Gene in den KS Tumorgewebe Mikroumgebung ermöglichen die Entwicklung von in vitro und anschließend in vivo-Modell für Entdeckung und Bewertung potenzieller neuer therapeutischer für die Behandlung von KS.
Protocol
Discussion
Die Methoden in diesem Bericht verwendet werden kann in einer Vielzahl von Labor-Einstellungen vorgenommen werden. Sie erfordern eine spezielle Ausrüstung oder den Zugang zu zentralen Einrichtungen. Die entsprechenden Vorsichtsmaßnahmen zu treffen, wenn dabei Experimente mit infektiösen viralen Krankheitserreger wie KSHV, die den Einsatz einer mit Gentechnik-Stufe 3 (BSL-3) Einrichtungen erfordern kann. Tissue Akquisitionen müssen auch von den entsprechenden Institutional Review Boards (Ethikkommissionen) genehmigt …
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir danken James EK Hildreth, Meharry Medical College, für seine Beratung und Überprüfung des Manuskripts. Wir danken auch Diana Marver für die Bearbeitung des Manuskripts. Zentrum für AIDS Gesundheit Disparitäten Forschung, NIH 5U54 RR019192-05;; die Meharry Zentrum für Klinische Forschung, NIH Grant P20RR011792; Diese Arbeit wurde von der Vanderbilt Meharry Center for AIDS Research (NIH P30 AI054999-05) unterstützt und von NIH gewähren P01 CA113239. DJA wurde teilweise durch Piloten Zuschüsse aus dem Vanderbilt-Meharry Center for AIDS Research (CFAR) und die Meharry Zentrum für Klinische Forschung (CRC) finanziert.
Materials
| Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| RPMI 1640 | Invitrogen | 05-0001DJ | ||
| TPA | Sigma | P1585 | ||
| PBS pH 7.4 | Invitrogen | 10010-023 | ||
| Sodium butyrate | Sigma | 19364 (FLUKA) | ||
| EBM-2 media | Lonza | CC-3156 | + bullet kits supplement | |
| DMVEC cells (HMVEC) | Lonza | CC2543 | ||
| Fetal calf serum | Hyclone | SH30066.03 | ||
| Penicillin/streptomycin | Invitrogen | 15140-122 | ||
| Chamber slides | Nalgene | 154461 | ||
| KSHV LANA Mab | Vector Labs | VP-H913 | 1:50 dilution/IFA | |
| Galectin-3 goat pAb | R&D Systems | AF1154 | ||
| Donkey-anti-goat FITC | Jackson ImmunoRessearch | 705-095-1 | ||
| Donkey-anti-goat Rho | Jackson ImmunoRessearch | 705-295-003 | 1:100 dilution/IFA | |
| Mounting media | Vector Labs | H 1500 | Vectashield with DAPI | |
| BCA Protein Assay Kit | Pierce | 23235 | ||
| Nitrocellulose | Bio-Rad | 161-0112 | ||
| Donkey-anti-goat-conj. | Santa Cruz | SC 2020 | ||
| Western substrate | Pierce | 34075 | ||
| Biotin-rabbit-anti goat | DAKO | 305-065-045 | ||
| AP-Strepavidin conj. | DAKO | K 0492 (kit) | ||
| RNase DNase Free Set | Qiagen | 79254 | ||
| MJ Mini Cycler | Bio-Rad | PTC-1148C | ||
| Bio-Photometer | Eppendorf | 952000006 | ||
| RC 6 Plus Centrifuge | Sorvall | 46910 | ||
| Coulter Optima L-90K Ultracentrifuge | Beckman | 392052 | ||
| MYiQ iCycler Real Time PCR Detection System | Bio-Rad | 170-9770 | ||
| TE 2000S Fluorescent microscope | NIKON | TE2000S | ||
| 2100 Bioanalyzer | Agilent | G2938C | ||
| Eclipse E 200 | NIKON | E 200 | ||
| Sorvall Legend RT Centrifuge | Thermo | 75004377 |
Referências
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