Microinjections תוך ורידי של הזחלים דג הזברה לחקר פגיעה כליות חריפה

Summary

אנו מתארים טכניקה של microinjecting aminoglycoside, גנטמיצין, תוך 2 ימים שלאחר fetilization (DPF) הזחלים דג הזברה לגרום לפציעה כליות חריפה (AKI). כמו כן, אנו מתארים שיטה אימונוהיסטוכימיה הר שלמה, פלסטיק הטבעה ואת חתך של הזחלים דג הזברה לדמיין את הנזק בתיווך AKI.

Abstract

במאמר זה אנו מתארים וידאו דגם דג הזברה של AKI באמצעות גנטמיצין כמו nephrotoxicant. טכניקה מורכבת microinjections תוך ורידי על דג הזברה 2 DPF. טכניקה זו מהווה שיטה יעילה ומהירה כדי לספק חומרים מסיסים למחזור הדם של הזחלים דג הזברה, ומאפשר הזרקה של דגים 15-20 לשעה. בנוסף AKI מחקרים, טכניקה זו microinjection יכול לשמש גם עבור סוגים אחרים של מחקרים ניסיוניים כגון אנגיוגרפיה. אנו מספקים פרוטוקול מפורט של הטכניקה מציוד נדרש אמצעים החזותיים של ירידה בתפקוד הכליות. בנוסף, אנחנו גם מדגימים את תהליך, אימונוהיסטוכימיה קיבעון הר שלם עם סמן כליה אבובית, הטבעה פלסטיק חתך של דג הזברה הזחל. אנו מראים כי הזחלים דג הזברה הוזרקו גנטמיצין להראות תכונות מורפולוגיות בקנה אחד עם AKI: בצקות, אובדן הקוטביות בתא הפרוקסימלי לתאי האפיתל צינורי, והפרעה המורפולוגי של אבובית.

Protocol

חלק מן הפרוטוקול הבא מבוסס על שיטות דיווח שפורסם על ידי (Hentschel et al. 2005) ו – (ויינשטיין et al. 1995) עם שינויים קלים. חלק 1: Microinjections הגדר מראש microinjection הדגים מוזרקים ב 2 ימים לאחר ההפריה (DPF). לכן, דג הזברה מבוגר הם גידלו 3 לילות לפני הניסוי המתוכנן. איסוף עוברים ומניחים אותם בצלחת פטרי עם מים E3 (NaCl 5mm, 0.17mM KCl, 0.33mM CaCl 2, 0.33mM MgSO 4) על 28.5 ° C. בסוף היום הראשון להסיר עוברים מתים בצלחת פטרי עוברים נפרדים, כך יש 80-100 עוברים לכל צלחת פטרי. הכינו את המחטים זכוכית משיכת משפופרות נימי (4 ס"מ אורך, 0.63 / 0.20 OD / מזהה מילימטר (מ"מ) R-6 זכוכית אישית Tubing דראמונד מדעי החברה, Broomall, הרשות 9-000-3000) עם חולץ אלקטרודה. הקוטר צריך להיות טיפ של 10-20 מיקרומטר. תחת מיקרוסקופ לנתח (לייקה S6E), עם הסמן קבע למשוך כ -10 קווי 1mm לאורך המחט, בעזרת סרגל, ולאחסן את המחטים בצלחת פטרי גדולה על רמפות חימר. הכן את פיפטה מחזיקה: Fire-ללטש את קצה שפופרת זכוכית חומה דקה בורוסיליקט נימי (152 מ"מ, 1 / 0.75 OD / מזהה מ"מ TW100-6, מכשירים העולם Precision, Inc) באש מבער בונזן עד לקוטר הפנימי של קצה הוא 0.4-0.5 מ"מ. מימד כזה מאפשר אחיזה טובה של שק החלמון של הזחלים 2 דג הזברה DPF. החזק קצה אחד של פיסת זכוכית נימי באמצעות מלקחיים ארוכים, החום קצה מול עם של נימי עם מבער בונזן, הצבתו אנכית מעל חרוט האור הפנימי הכחול של הלהבה, החלק החם ביותר, עבור 1-2 שניות, גלגול זה להשיג אפילו להתמוסס. חזור על פעולה זו מספר פעמים ולאחר מכן לבחון את נימי תחת מיקרוסקופ, על הבמה מיקרומטר (94 וורד של 9910 W). זהו צעד קריטי, ייתכן שיהיה צורך אש פולנית pipettes מחזיק כמה ובחר בגודל המתאים מאוחר יותר, בזמן שאתה מניפולציה של הזחלים. אם אתה זהיר, אחד מחזיק פיפטה נמשך הפעלות microinjection מרובים. מלאו את Microsyringe משאבה ידנית (MMP, העולם Precision מכשירים, Inc,) עם שמן מינרלי, בעקבות ההוראות שניתנו על ידי היצרן. בעל פיפטה מוכנס מניפולטור ג'ויסטיק (Narishige, MN-151), קשור לעמוד מגנטי (Narishige, MN 151) על צלחת ברזל (Narishige, IP). Microinjection הכן 20μl של התערובת הזרקה:. 2.4μl גנטמיצין (סיגמא אולדריץ G8648, 50mg/ml בתוך תמיסת מלח) ו 17.6μl 10-kDa לוציפר צהוב dextran (Invitrogen D1825, (1mg/ml בתוך תמיסת מלח) על הדגים שולטים גנטמיצין מוחלף עם תמיסת מלח. dextran ניאון (צבעים שונים יכולים לשמש) מספיקה כדי לזהות את הדיוק של הזריקה ובחר הזחלים כי כבר הוזרקו nephrotoxicant. הכן 2 30mm צלחות פטרי עם שמן מינרלי 2ml עבור הצבת את התערובת הזרקת תערובת תחת בקרה, כדי למנוע אידוי של הפתרונות. הכן את ההרדמה: 400 מ"ג אבקת tricaine (אתיל-m-aminobenzoate methanesulfonate SIGMA A-5040) 97.7 מ"ל מים DD, 2.1 מ"ל 1M טריס (pH 9). התאם את ה-pH 7. בחנות זו פתרון מניות במקפיא, ב aliquots של 4.2 מ"ל. כדי להשתמש tricaine כמו הרדמה לדלל את 4.2 מ"ל פתרון tricaine המניות מ"ל מים 100-E3 (Westerfield 1993) ומשאירים בטמפרטורת החדר. השלבים הבאים מתבצעים תחת מיקרוסקופ לנתח הסרה ידנית כל chorions הנותרים עם מלקחיים בסדר להרדים דג הזברה והעברתם בצלחת פטרי עם tricaine חימם בטמפרטורת החדר. דג הזברה צריכים להיות חשופים tricaine לפחות 15 דקות לפני תחילת microinjections. פתח את קצה המחט להזרקת באמצעות סכין גילוח (VWR מדעי 55411-050). החזק את הלהב בזווית קלה כדי ליצור שיפוע וחתך את קצה כגון להשיג פתיחת קצה בקוטר כ 10-20μm. הפעל ואקום כוח, אספקת אוויר המנגנון microinjection (World דיוק מכשירים בע"מ, PV820 פנאומטי picopump). הכנס את המחט לתוך מחזיק מחט רכוב על בסיס micromanipulator ו הטיית (Precision Word מכשירים, Inc, דגם M3301R, TB-1). כדי למלא את המחט, מקום טיפה (10μl) של הפתרון להיות מוזרק בצלחת פטרי 30mm מלא שמן מינרלי (פישר כימיקלים, 0121-1). סובבו את micromanipulator ידנית כדי להטביע את קצה המחט ירידה של פתרון, להגדיר את picopump "להחזיק / פורקן" לעבור "פורקן" ("פתח" משווה ואקום על PV820), ולמלא את המחט על ידי משיכת פתרון באמצעות קצה המחט. זה ייקח כמה דקות, אם הפתרון נכנסת המחט מהר מדי,משמעות הדבר היא הקוטר של קצה גדול מדי, וזריקות לא יהיה מדויק. לאחר מחט מלאה, להגדיר את picopump "להחזיק" ("להחזיק" משווה להזריק על PV820). כדי לכייל את המחט, להגדיר את picopump "מגודרת / מתוזמן" לעבור "מגודרות", לחץ על דוושת רגל לפרוק את המחט, ולהקליט את משך הזמן שלוקח (שניות) של המניסקוס לנסוע מאחד סימון למשנהו (1 המרחק הכולל מ"מ). חזור 3 פעמים, לקחת את הזמן הממוצע (בשניות), ולחלק את הערך על ידי 30 (נפח nanoliters (nl) המתאים למרחק 1 מ"מ ליניארית) כדי לקבוע את מספר אלפיות השנייה נדרש לספק 1 nl של פתרון. כוון את חוגת תקופה טווח למספר זה, ולהעביר את "מגודרת / מתוזמן" לעבור "מתוזמן". עכשיו picopump מוגדר לספק הדופק 1nl של פתרון. הסר את שמן מינרלי צלחת ולמקם את צלחת פטרי עם הזחלים מתחת למיקרוסקופ. קבוצת הדג במרכז צלחת פטרי ולהתמקד. מניחים את פיפטה ההחזקה המשאבה microsyringe ידנית (MMP, מכשירים העולם דיוק) בצד הנגדי של microinjector, לקדם קצהו כדי בצלחת פטרי, אל מישור המוקד של המיקרוסקופ. בנד זה עם זווית רדוד למדי, כך טיפ מאוד של פיפטה מחזיקה נוגע בתחתית צלחת פטרי והוא קרוב אופקי. ודא שלא צריך כל בועת אוויר במערכת, אשר יאט את זמן התגובה ולהפחית את רמת הדיוק של MMP. שנה ל ההגדלה גבוה יותר על המיקרוסקופ ולהשתמש עפעף superfine עם ידית (טד פלה 113) כדי למקם את הצד הזחל הגב דגים למטה עם חלמון קרוב מאוד פיפטה מחזיקה. החזק את הדגים הזחל על ידי מוצץ את החלמון לתוך פיפטה מחזיקה על ידי סיבוב נגד כיוון השעון את הכונן מיקרומטר השליטה microsyringe משאבה ידנית. יש להיזהר שלא להפוך את מיקרומטר רחוק מדי, כמו חלמון יכול להתפוצץ אם משך עמוק מדי לתוך פיפטה מחזיקה. פוקוס על הווריד להרכיב את הקרדינל נפוץ, הנמצא על החלמון, ממש מתחת periderm וגם הוא האתר של זרימת דם גבוהה מאוד. עם micromanipulator של מנגנוני זריקה, מדריך את המחט לתוך הווריד לפתח את הקרדינל משותף. זה בדרך כלל יש צורך לשלוף את המחט קצת אחורה לאחר הכניסה, כמו וריד הקרדינל נפוצה היא שטחית מאוד. הזרק 1nl של פתרון על ידי לחיצה על דוושת רגל, ולאחר מכן שחרר את הזחלים מן פיפטה מחזיקה ולהחזיר את המים העובר. זהו צעד קריטי, במיוחד בפעם הראשונה, מכיוון שהיא דורשת מידה מסוימת של תרגול במיצוב דגים השליטה היניקה הלחץ של המתקן. אם החלמון של העובר מוחזק כראוי עם פיפטה מחזיק, זה לא רול כמו מחט נכנס. כדי לוודא את הצלחת microinjection, הצג נוכחות של לוציפר dextran צהוב בלב ליבה של דג הזברה תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי. צהוב לוציפר נשאר גלוי בלב למשך כ 20 דקות לפני מתפוגג אל תוך מערכת הדם אם הפתרון nephrotoxic מוזרק כהלכה, תוך 2 שעות של הזריקה תוכלו לראות מעט מאוד לוציפר צהוב dextran הנותרים באתר ההזרקה. אם הפתרון הוא הזריק את שק החלמון, נקודה של לוציפר צהוב dextran יישארו באתר ההזרקה. (איור 1). מחזירים את הדגים עד בינוני E3. יומיים לאחר ההזרקה, הזחלים להתפתח בצקת קרום הלב כתוצאה של ירידה בתפקוד הכליות (איור 2). חלק 2: קיבוע ו immunofluorescence עם Na + / K + ATPase נוגדן (α-6F) ב DPF 4, לשים בין 10 ל 15 דג הזברה הזחל בתוך צלוחיות זכוכית 4ml (Weathon, 225,012) ולתקן אותם 1ml של דנט (80% MeOH DMSO 20%) למשך 4 שעות בכל RT. רעננותם עוברים MeOH ציון / PBT (PBS עם 0.5% Tween20) סדרה, 75:25 50:50, 25:75, PBT 100%, pipetting הפתרון החוצה והוספת פתרון חדש בקבוקון זהה (1ml של פתרון לכל בקבוקון), 20 דקות כל פתרון. הזחלים לא צריך להיות חשוף לאוויר, להשאיר פתרון קטן המכסה את הזחלים בעת שינוי פתרונות. הסר PBT ולהחליף 1ml עם פתרון חסימה (PBS עם DMSO 1%, 0.5% Tween20, 10% נסיוב עז רגיל) במשך 3 שעות ב 4 ° C על nutator. מעבירים את הזחלים בתוך microfuge 2ml. הסרת חסימה בסרום ולהחליף נוגדן ראשוני 300μl בפתרון הדגירה (PBS עם DMSO 1%, 0.5% Tween20, עז רגיל 2% נסיוב) לילה ב 4 ° C על nutator. אנו משתמשים חד שבטיים Na + / K + ATPase נוגדן (α-6F, supernatant, לימודי התפתחותית Hybridoma בנק, איווה) בשעה 1:25 דילול הסר את הנוגדן הראשוני לשטוף 3 x 30 דקות עם פתרון הדגירה ב RT. דגירה עם נוגדנים משני (עז אנטי עכבר cy3, ג'קסון Immunoresearch Laboratories, Inc 155-165-003) מדולל 1:500 בפתרון הדגירה של 2 שעותRT. לשטוף 3 x 30 דקות עם PBT. חלק 3: הטבעה פלסטיק עם JB-4 מייבשים רקמות באמצעות סדרה אתנול מדורגים (50%, 75%, 95%, 100% x 2), 10 דקות לכל שלב. הכן את פתרון חדירה: 25 מ"ל הפתרון JB 4-Embedding (Polysciences 0226A) ו 0.24g של זרז (Polysciences 02,618). זה לוקח זמן הזרז לפזר כ 20-30 דקות. הפתרון יכול להיות מאוחסן על 4 מעלות צלזיוס עד חודש 1. למזוג מעל 100% אתנול ולהחליף פתרון חדירה פלסטיק. מניחים את בקבוקוני 4 ° C על הכתף ולאפשר חדירה להמשיך עד הכיור הזחלים אל החלק התחתון של בקבוקון הזכוכית. תהליך זה בדרך כלל לוקח בערך 30 דקות. הטמעת פרוטוקול: מניחים את דפוס פלסטיק כוס מגש (Polysciences, Inc 16643A) תחת מיקרוסקופ לנתח. מעבירים את הזחלים, יחד עם פתרון חדירה כדי לכסות, לספלים. התקשורת הטבעה פלסטיק מוכנה בתוך צינור פלסטיק קטן. בדרך כלל אנחנו להטביע 4-5 דגים בכל פעם, דג אחד עבור כל כוס. הכן 5-6 מ"ל של פלסטיק הטבעה (1.2 מ"ל של הטמעת פתרון עבור כל כוס) הוספת 35 μl של JB-4 פתרון הטבעת "B" (Polysciences בע"מ 0226B) עבור מ"ל כל אחד פתרון חדירה. הוסף 35 μl של JB-4 פתרון הטבעת "B" (Polysciences בע"מ 0226B) עבור מ"ל כל אחד פתרון חדירה. מערבבים היטב, pipetting מעלה ומטה עם פעמים פיפטה פסטר מפלסטיק מספר. זה חשוב כי אם לא מעורבב היטב את JB-4 לא לפלמר כראוי. לאחר 5 מ"ל של פלסטיק הטבעה הוכן, להסיר פלסטיק חדירה מרחבי דגימות עם פיפטה פסטר. מלאו את כוס פלסטיק עם הטבעה. פלסטיק חייב לטפטף מתוך כוס, כדי להבטיח התקשרות טובה של בעל לחסום את הדגימה. כדי לזהות דג הזברה tubules כליות, קטעי רוחבי הם הטובים ביותר. לענין זה, הדגים המוטבעים במאונך, ראשו מורכן. בעזרת ריסים עם ידית או מלקחיים בסדר, מעת לעת העמדה דגים אנכית, עד הפלסטיק הוא די קשה כי הם לא זזים ממקומם. זה לוקח בערך 20-30 דקות. לאחר מכן, המקום מחזיק EBH-2 Block (Polysciences בע"מ 15,899) על כוסות ולהשאיר את המגש 4 ° C למשך הלילה. כאשר פילמור של שלמה, אתה יכול לקפוץ החוצה את אבני כמו קוביות קרח. הטמעת פרוטוקול חלופי עבור הזחלים מספר: מילוי תבניות באמצע הדרך להשלים עם JB-4 ולאפשר לו לפלמר. במשך 15 תבניות מ"מ מרובע אנו משתמשים נפח JB-4 ב 700μl למלא את התבנית באמצע הדרך. לאחר מכן, להוסיף את הזחלים JB-4 ספוגה hardener את טרום polymerized חצי מלא עובש. אוריינט הזחלים עם ראש והצביעה אל הצד הרחוק של עובש וליישר את הזחלים כל כך העיניים קו (אתה יכול לשים 10 דגים עובש יחיד בקו). לאחר לחסום polymerized אתה יכול לגזור את הקצוות לחסום, להפוך אותו כל כך בצד ניצבת בפני את הסכין דבק מגע זה פלסטיק "צ'אק" שמתאים microtome. באמצעות שיטה זו ניתן למקם מספר רב של זחלים באותו גוש בניינים, שמרכזה הפלסטיק, ומוכן חתכים. טיפול יש לקחת המכוונת לחסום את הסכין כך בסעיפים מקבילים של דגים כל נלקחים בסעיף אחד. ניתן להשיג זאת תוך חתך דרך העיניים: כלומר לכוון את הבלוק כל כך קטעים המקבילה של העיניים נלקחים כל הדגים. התוצאה הסופית היא, כי אתה יכול לנתח דגים רבים במקביל על המיקרוסקופ שקופית אחת. חלק 4: חתך הגדר את הדגימה לתוך מחזיק צ'אק של microtome (אנו משתמשים עדינות Shandon Thermo אלקטרו תאגיד microtome) הגדר את השקופית חמים עד 45 ° C. יוצקים מים DI לתוך מבחנה ולמקם אותו קרוב microtome לפני חתך, הקפד לחסום מכוונת כגון להשיג חלקים רוחבי מושלם של הדג. ראש אוריינטציה מנופים הסתגלות ניתן לסובב המאפשר לתפקיד ראש הדגימה במדויק הסכין. התחל חיתוך קטעים עבה דרך הראש של הדג. בעוד חתך דרך העיניים, לכוון את הבלוק כל כך קטעים המקבילה של העיניים נלקחים כל הדגים. כאשר סנפירי החזה מופיעים הסעיפים, כלומר כאשר tubules pronephric להתחיל. מנקודה זו, לגזור על 32 סעיפים 4 אממ מהגוש. איסוף החלקים עם מלקחיים ולתת להם טיפה לתוך כוס עם מים, בלי לגעת במים עם מלקחיים. סעיף תרחיב ברגע שהוא פוגע פני המים, עכשיו אתה יכול לאסוף אותו בשקופית. הכנס את השקופית לתוך המים בזווית של ° 45 ו גישת סעיף בעזרת ריסים עם ידית, נוגע רק בגבולות הסעיף. דגירה השקופיות בשקופית חם עד יבש לחלוטין. תמונה קטעים באמצעות מיקרוסקופ epifluorescent או confocal. חלק 5: נציג Resאולטס כאשר מבוצע כהלכה, דגים מוזרק להופיע כמו בתרשים 1, עם קצת ניאון dextran (במקרה זה לוציפר צהוב) גלוי בלב ובמערכת הדם. אם הזריקה עמוקה מדי, החומר מוזרק ניתן לראות מרוכזים שק החלמון, או את הלב יכול להיות ניקב גורם לדימום מוגזם. אם פיפטה מחזיק עשוי כהלכה, הדגים לא תגלגל או להעביר כאשר הוא מוזרק, וזה יאפשר הזרקה מדויקת יותר. כמו כן, חשוב לוודא שלא יהיה כל בועות האוויר MMP, אשר יאט את זמן התגובה ולהפחית את רמת הדיוק של המערכת. בדרך כלל, כתוצאה nephrotoxicity גנטמיצין, 80% של הדג מוזרק לפתח בצקת קרום הלב (איור 2). אנו משתמשים במערכת הסיווג מבוסס פנוטיפ, שבו הדג עם בצקת מתונה להראות בצקת קרום הלב מאליו אבל אחרים לא הנצפה פנוטיפים, ואילו קשות דגים בצקי להראות בצקת קרום הלב ואת תא המטען, עם קלה עד בינונית עקמומיות ציר. באמצעות נוגדן אבובית הכליה נגד Na + / K + ATPase (α-6F) אנחנו יכולים לדמיין את tubules פגום בסעיפים רוחבי, עם הפסד ניכר של קוטביות התא שיבוש צינורי tubules פגום בהשוואה לקבוצת הביקורת (איור 3). דפוס זה עולה בקנה אחד באמצעות סעיפים רוחבי מרובים. על מנת לקבל חלקים רוחבי מושלמת של tubules כליות חשוב למקם את הדג כראוי במהלך הטבעת. בהשוואת חלקים, סנפירי החזה ואת tubules מפותל הפרוקסימלי המשמשים כסמנים אנטומי. באיור 1. Microinjection Nephrotoxin. (א) זריקה מוצלחת של dextran 10kDa מצומדות כדי לוציפר צהוב, עם ביטוי עמום ברוח הקרדינל משותף, חץ לבן. (ב) הזרקה שגויה, וכתוצאה מכך הפקדה של 10kDa dextran מצומדות לצהוב לוציפר שאינה מתפוגגת לתוך מערכת הדם, חץ אדום. איור 2. גנטמיצין בתיווך בצקת. (א) בקרה מוזרק דג הזברה הזחל. גנטמיצין מוזרק הזחל עם דג הזברה (ב) או מתונה (C) בצקת חמורה. כל הזחלים נמצאים DPF 4 עם הקדמי שמאלה הגבי הוא למעלה. חיצים שחורים הצבע בצקת קרום הלב ב B ו-C איור 3. AKI אימונוהיסטוכימיה. α-6F נוגדן מכתים עבור Na + / K + ATPase הזרקת גנטמיצין 48 שעות שלאחר (4 זחלים DPF) שליטה (A, B) ו מוזרק גנטמיצין (C, D) הזחלים. A, C הם בהגדלה 20X של B ו-D הם בהגדלה דיגיטלי 3X של tubules ממש הפסד ו-C הערה של הקוטביות basolateral והפרעה אבובית, חץ לבן, ד 'בהשוואה ל B.

Discussion

במאמר זה הראינו וידאו טכניקה microinjection תוך ורידי עבור דגם AKI, על ידי יצירת נזק בתיווך גנטמיצין צינורי הפרוקסימלי של הזחלים דג הזברה. פגיעה זו גורמת להיווצרות של קרום הלב ו / או בצקת חמורה, המשקפת חוסר יכולת לווסת את מאזן המים. אנחנו גם תיאר ניסוי אימונוהיסטוכימיה עם נוגדן אשר סימוני tubules כליות הבדיל (Majumdar et al. 2000), מראה הפסד של קוטביות התא שיבוש אבובית הפרוקסימלית בכליות פגום. Microinjections תוך ורידי מייצגים שיטה יעילה לאספקת חומר מסיס למחזור הדם של הזחלים דג הזברה. טכניקה זו היא כלי מצוין עבור כניסתה של מגוון רחב של חומרים בעזרת זריקות אחיד פלורסנט סמן ניתן לחזור פעמים רבות ומאפשר תוצאות עקביות.

Materials

Material Name	Tipo	Company	Catalogue Number	Comment
α6F mouse monoclonal		Developmental study Hbridoma Bank
Block Holder EBH-2		Polysciences, Inc.	15899
Borosilicate Glass Capillaries		World Precision Instruments, INC	TW100-6
Capillary tubes R-6 Custom Glass Tubing		Drummond Scientific Company, Broomall PA	9-000-3000
Catalyst Powder		Polysciences, Inc.	02618
Cy3		Jackson Immunoresearch Laboratories, Inc.	155-165-003
Dextran 10k Lucifer yellow, lysine fixable		Molecular probes	D1825
DMSO		Sigma	D8418
Eyelash		Ted Pella	113
Gentamicin sulfate		Sigma-Aldrich	G8648
Glass vials 4ml		Weathon	225012
Iron plate		Nariscige	IP
JB-4 Embedding Solution A		Polysciences Inc.	0226A
JB-4 Embedding Solution B		Polysciences, Inc.	0226B
Joystick micromanipulator		Narishige	MN 151
Magnetic stand		Narishige	MN-151
Manual microsyringe pump		World Precision Instruments, Inc
Microinjection apparatus		World Precision Instruments, Inc.	PV820
Micromanipulator		World Precision Instruments, Inc.	M3301R
Microtome		Thermo Electro Corporation	Shandon Finesse
Mineral oil, light		Fisher Chemicals	0121-1
Pipette puller		Kopf	720
Plastic molding cup tray		Polysciences, Inc.	16643A
Razor blade		WVR Scientific	55411-050
Slide warmer		Lab line
Stage micrometer		Wards	94 W 9910
Tilting base		World Precision Instruments, Inc.	TB 1
Tricaine powder		Sigma	A-5040
Tween 20		Sigma	P7949
Microscope		Leica	S6F	Dissecting microscope
Microscope		Leica	M205FA	Fluorescent microscope