In situ Protocol voor Butterfly Wings popstadium gebruik riboprobes
Summary
Om genexpressie te onderzoeken in het popstadium vleugel weefsel van Bicyclus anynana, presenteren we een geoptimaliseerd protocol voor in-situ hybridisaties met behulp van riboprobes. We bieden ook richtlijnen voor de verdere optimalisatie van dit protocol voor het gebruik in popstadium vleugels van andere lepidoptera soorten.
Abstract
Hier presenteren wij, in video-formaat, een protocol voor het in situ hybridisaties in popstadium vleugels van de vlinder Bicyclus anynana met behulp van riboprobes. In situ hybridisaties, een steunpilaar van de ontwikkelingsbiologie, zijn nuttig om de ruimtelijke en temporele patronen van genexpressie studie in de ontwikkeling van weefsels op het niveau van transcriptie. Als antilichamen die het eiwit producten van gentranscriptie doelgroep zijn nog niet ontwikkeld en / of er meerdere genen exemplaren van een bepaald eiwit in het genoom die niet kan worden gedifferentieerd gebruik van beschikbare antilichamen, kan in situs plaats daarvan worden gebruikt. Terwijl de een in-situ techniek voor de larven vleugel disks beschikbaar is geweest voor de vlinder community voor meerdere jaren, heeft het huidige protocol is geoptimaliseerd voor de grotere en meer kwetsbare popstadium vleugels.
Protocol
Discussion
Optimalisatie van bestaande protocollen
In situ hybridizaties op larvale vleugel schijven zijn met succes uitgevoerd met behulp van schijven van Precis coenia vlinders (Carroll et al., 1994;. Keys et al. 1999;. Weatherbee et al. 1999.). Het huidige protocol is een aangepaste versie van een schriftelijk en gedetailleerd protocol beschikbaar op verzoek van de Carroll Lab de larven vleugel kleuringen. De veranderingen die we dienen om de verschillen tussen larvale en popstadium vleugel weefsels tegemoet te komen. Tijdens pupal hindwing…
Acknowledgements
Wij danken Jayne Selegue, Margaret Hollingsworth, Jin Berry, Ryo Futahashi, Najmus Sahar Mahfooz, Aleksandar Popadic, Bob Reed, Roche technische ondersteuning voor hulp bij het oplossen van dit protocol. We danken ook William Piel voor advies over het bewerken van de film.
Materials
| Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Fix Buffer | 4% Paraformaldehyde in PBS | |||
| PBT | 0.1% Tween 20 in PBS | |||
| Proteinase K solution | 2.5g/ml Proteinase K in PBT | |||
| Digestion Stop Buffer | 2 mg/ml glycine in PBT | |||
| Pre-Hybridization Buffer | For 50 ml PHB: 12 ml DEPC treated water + 25 ml Formamide + 12.5 ml 20 x SSC + 50 ul Tween 20 + 500 ul 10 mg/ml salmon sperm (Rnase free, heat denatured prior to addition to solution). | |||
| Hybridization Buffer | Add 1 mg/ml glycogen to prehybridization buffer | |||
| Block Buffer | 50 mM Tris pH 6.8, 150 mM NaCl, 0.5% IGEPAL (NP40), 5 mg/ml BSA | |||
| Anti-DIG | Ab | Roche Applied Science | 11 093 274 910 | Alkaline Phosphatase conjugated |
| DIG Wash and Block Buffer Set | Roche Applied Science | 11 585 762 001 | ||
| Crystal Mount Aqueous Mounting Medium | Sigma | C0612 | Mounting Medium |
Referências
- Carroll, S. B., Gates, J., Keys, D. N., Paddock, S. W., Panganiban, G. E. F., Selegue, J. E., Williams, J. A. Pattern formation and eyespot determination in butterfly wings. Science. 265, 109-114 (1994).
- Chomczynski, P. Solubilization in formamide protects RNA from degradation. Nucleic Acids Research. 20, 3791-3792 (1992).
- Keys, D. N., Lewis, D. L., Selegue, J. E., Pearson, B. J., Goodrich, L. V., Johnson, R. J., Gates, J., Scott, M. P., Carroll, S. B. Recruitment of a hedgehog regulatory circuit in butterfly eyespot evolution. Science. 283, 532-534 (1999).
- Marcus, J. M., Ramos, D. M., Monteiro, A. Germ line transformation of the butterfly Bicyclus anynana. Proc R Soc Lond B (Suppl). 271, S263-S265 (2004).
- Monteiro, A., Glaser, G., Stockslagger, S., Glansdorp, N., Ramos, D. M. Comparative insights into questions of lepidopteran wing pattern homology. BMC Developmental Biology. 6, 52 (2006).
- Ramos, D. M., Kamal, F., Wimmer, E. A., Cartwright, A. N., Monteiro, A. Temporal and spatial control of transgene expresson using laser induction of the hsp70 promoter. BMC Developmental Biology. 6, 55 (2006).
- Weatherbee, S. D., Nijhout, H. F., Grunert, L. W., Halder, G., Galant, R., Selegue, J., Carroll, S. Ultrabithorax function in butterfly wings and the evolution of insect wing patterns. 9, 109-115 (1999).
