Afin d'examiner l'expression des gènes dans les tissus des pupes de l'aile Bicyclus anynana, nous présentons un protocole optimisé pour les hybridations in situ en utilisant des ribosondes. Nous fournissons aussi des directives pour l'optimisation de ce protocole pour l'utilisation dans les ailes des pupes de espèces de lépidoptères autres.
Abstract
Nous présentons ici, en format vidéo, un protocole pour les hybridations in situ dans les ailes des pupes de l'anynana papillon Bicyclus utilisant ribosondes. Hybridations in situ, un pilier de la biologie du développement, sont utiles pour étudier la répartition spatiale et temporelle de l'expression des gènes dans le développement de tissus au niveau de la transcription. Si des anticorps qui ciblent les produits de protéine de transcription des gènes n'ont pas encore été développée, et / ou il ya de multiples copies du gène d'une protéine particulière dans le génome qui ne peuvent pas être différenciés en utilisant des anticorps disponibles, situs peut être utilisé à la place. Alors une technique in situ pour les disques ailes larvaires ont été offerts à la communauté papillon pour plusieurs années, le protocole actuel a été optimisé pour les ailes plus grandes et plus fragiles chrysalide.
Protocol
JOUR 1 Préparer les solutions suivantes: 10x PBS 1x PBS 1x PBT ddH 2 O Ajouter DEPC pour un volume total de 0,1% et secouer vigoureusement solutions. Autoclave. Fix paraformaldéhyde à 4% – à l'aide de PBS-DEPC Solution de protéinase K – Si un précipité apparaît, vortexer vigoureusement avant de retirer aliquote Tampon d'arrêt Digestion Tampon de préhybridation 50:5…
Discussion
Optimisation des protocoles existants
Hybridations in situ sur des disques de l'aile des larves ont été réalisées avec succès en utilisant des disques à partir des papillons coenia Précis (Carroll et al, 1994;. Keys et al, 1999;. Weatherbee et al 1999).. Le protocole actuel a été adapté à partir d'un protocole écrit détaillé disponible sur demande auprès du laboratoire Carroll pour colorations aile larvaire. Les changements que nous a fait servir à tenir compte des différences entre les tissus des larves et …
Acknowledgements
Nous tenons à remercier Jayne Selegue, Margaret Hollingsworth, Jin Berry, Ryo Futahashi, Najmus Sahar mahfouz, Aleksandar Popadic, Bob Reed, Roche support technique pour aider au dépannage de ce protocole. Nous remercions également Guillaume Piel pour des conseils sur le montage du film.
Materials
Material Name
Tipo
Company
Catalogue Number
Comment
Fix Buffer
4% Paraformaldehyde in PBS
PBT
0.1% Tween 20 in PBS
Proteinase K solution
2.5g/ml Proteinase K in PBT
Digestion Stop Buffer
2 mg/ml glycine in PBT
Pre-Hybridization Buffer
For 50 ml PHB: 12 ml DEPC treated water + 25 ml Formamide + 12.5 ml 20 x SSC + 50 ul Tween 20 + 500 ul 10 mg/ml salmon sperm (Rnase free, heat denatured prior to addition to solution).
Hybridization Buffer
Add 1 mg/ml glycogen to prehybridization buffer
Block Buffer
50 mM Tris pH 6.8, 150 mM NaCl, 0.5% IGEPAL (NP40), 5 mg/ml BSA