In situ-Protokoll für Butterfly Puppenstadium Flügel mit Ribosonden
Summary
Um die Genexpression in den Puppenstadium Flügel Gewebe Bicyclus anynana untersuchen, stellen wir ein optimiertes Protokoll für in situ Hybridisierungen mit Ribosonden. Wir bieten auch Richtlinien für die weitere Optimierung des Protokolls für den Einsatz in Puppenstadium Flügel der andere Lepidopteren Arten.
Abstract
Hier präsentieren wir Ihnen im Video-Format, ein Protokoll für in situ Hybridisierungen in Puppenstadium Flügel des Schmetterlings Bicyclus anynana mit Ribosonden. In situ Hybridisierungen, sind eine tragende Säule der Entwicklungsbiologie, nützlich, um die räumlichen und zeitlichen Muster der Genexpression in Geweben entwickeln auf der Ebene der Transkription zu studieren. Wenn Antikörper, die das Protein Produkte der Gen-Transkription Ziel noch nicht entwickelt worden, und / oder gibt es mehrere Genkopien eines bestimmten Proteins in das Genom, die nicht differenziert werden können mit den verfügbaren Antikörper ist, kann in situs verwendet werden. Während eine in-situ-Technik für die Larven Flügel-Discs verfügbar war, um den Schmetterling Gemeinde seit mehreren Jahren hat sich die aktuelle Protokoll für die größeren und fragile Puppenstadium Flügel optimiert.
Protocol
Discussion
Optimierung bestehender Protokolle
In situ Hybridisierungen auf Larven Flügel Scheiben erfolgreich durchgeführt wurden mit Scheiben aus Precis coenia Schmetterlinge (Carroll et al 1994;. Keys et al 1999;. Weatherbee et al 1999).. Das derzeitige Protokoll hat sich von einer ausführlichen schriftlichen Protokoll auf Anfrage von der Carroll Lab für die Larven Flügel Färbungen angepasst. Die Veränderungen, die wir gemacht dienen, um Unterschiede zwischen Larven-und Puppenstadium Flügel Gewebe aufnehmen. Während Puppenstadium Hi…
Acknowledgements
Wir danken Jayne Selegue, Margaret Hollingsworth, Jin Berry, Ryo Futahashi, Najmus Sahar Mahfooz, Aleksandar Popadic, Bob Reed, Roche Technical Support, um Hilfe bei der Fehlersuche dieses Protokoll. Wir danken auch William Piel um Rat bei der Bearbeitung des Films.
Materials
| Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Fix Buffer | 4% Paraformaldehyde in PBS | |||
| PBT | 0.1% Tween 20 in PBS | |||
| Proteinase K solution | 2.5g/ml Proteinase K in PBT | |||
| Digestion Stop Buffer | 2 mg/ml glycine in PBT | |||
| Pre-Hybridization Buffer | For 50 ml PHB: 12 ml DEPC treated water + 25 ml Formamide + 12.5 ml 20 x SSC + 50 ul Tween 20 + 500 ul 10 mg/ml salmon sperm (Rnase free, heat denatured prior to addition to solution). | |||
| Hybridization Buffer | Add 1 mg/ml glycogen to prehybridization buffer | |||
| Block Buffer | 50 mM Tris pH 6.8, 150 mM NaCl, 0.5% IGEPAL (NP40), 5 mg/ml BSA | |||
| Anti-DIG | Ab | Roche Applied Science | 11 093 274 910 | Alkaline Phosphatase conjugated |
| DIG Wash and Block Buffer Set | Roche Applied Science | 11 585 762 001 | ||
| Crystal Mount Aqueous Mounting Medium | Sigma | C0612 | Mounting Medium |
Referências
- Carroll, S. B., Gates, J., Keys, D. N., Paddock, S. W., Panganiban, G. E. F., Selegue, J. E., Williams, J. A. Pattern formation and eyespot determination in butterfly wings. Science. 265, 109-114 (1994).
- Chomczynski, P. Solubilization in formamide protects RNA from degradation. Nucleic Acids Research. 20, 3791-3792 (1992).
- Keys, D. N., Lewis, D. L., Selegue, J. E., Pearson, B. J., Goodrich, L. V., Johnson, R. J., Gates, J., Scott, M. P., Carroll, S. B. Recruitment of a hedgehog regulatory circuit in butterfly eyespot evolution. Science. 283, 532-534 (1999).
- Marcus, J. M., Ramos, D. M., Monteiro, A. Germ line transformation of the butterfly Bicyclus anynana. Proc R Soc Lond B (Suppl). 271, S263-S265 (2004).
- Monteiro, A., Glaser, G., Stockslagger, S., Glansdorp, N., Ramos, D. M. Comparative insights into questions of lepidopteran wing pattern homology. BMC Developmental Biology. 6, 52 (2006).
- Ramos, D. M., Kamal, F., Wimmer, E. A., Cartwright, A. N., Monteiro, A. Temporal and spatial control of transgene expresson using laser induction of the hsp70 promoter. BMC Developmental Biology. 6, 55 (2006).
- Weatherbee, S. D., Nijhout, H. F., Grunert, L. W., Halder, G., Galant, R., Selegue, J., Carroll, S. Ultrabithorax function in butterfly wings and the evolution of insect wing patterns. 9, 109-115 (1999).
