Riboprobes를 사용하여 나비 Pupal 날개에 대한해라 프로토콜
Summary
Bicyclus anynana의 pupal 날개 조직에서 유전자 발현을 조사하기 위해, 우리는 riboprobes를 사용하여 현장 hybridizations에 대한 최적화된 프로토콜을 제시한다. 우리는 또한 다른 Lepidopteran 종의 pupal 날개에 사용하기 위해이 프로토콜을 더욱 최적화에 대한 지침을 제공합니다.
Abstract
여기서 우리는, 비디오 형식, riboprobes를 사용하여 나비 Bicyclus anynana의 pupal 날개의 현장 hybridizations에 대한 프로토콜을 제시한다. 현장 hybridizations에서 발달 생물학의 의지는 전사 수준에서 조직 개발에 유전자 표현의 공간 및 시간적 패턴을 연구하는 데 유용합니다. 유전자 전사의 단백질 제품을 대상 항체가 아직 개발 및 / 또는 사용 가능한 항체를 사용하여 차별화된 수 없습니다 게놈에서 특정 단백질의 여러 유전자 사본이있다하지 않은 경우, 시터스 대신 사용할 수 있습니다. 애벌레 날개 디스크 현장 기술에 몇 년 동안 나비 커뮤니티에 제공하고있는 동안, 현재의 프로토콜은 더 큰 더 연약한 pupal 날개에 대한 최적화되었습니다.
Protocol
Discussion
기존 프로토콜의 최적화
애벌레 날개 디스크에 현장 hybridizations 성공적으로 대의 coenia의 나비의 디스크를 사용하여 수행되었습니다 (캐롤 외 1994;. 키 외 1999;. 웨더비 외 1999가).. 현재 프로토콜은 애벌레 날개 stainings에 대한 캐롤 연구소에서 요청에 따라 사용할 수있는 세부적인 서면 프로토콜에서 맞게되었습니다. 우리가 만든 변경 사항은 애벌레와 pupal 날개 조직 간의 차이를 수용할 수 있도록 제공하고 …
Acknowledgements
우리는 제인 Selegue, 마가렛 홀링스워스, 진 베리, 료 Futahashi, Najmus Sahar Mahfooz, 알렉산더 Popadic, 밥 리드,이 프로토콜을 문제 해결에 대한 도움을 로체 기술 지원을 주셔서 감사합니다. 우리는 또한 동영상을 편집에 대한 조언 윌리엄 피엘 감사합니다.
Materials
| Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Fix Buffer | 4% Paraformaldehyde in PBS | |||
| PBT | 0.1% Tween 20 in PBS | |||
| Proteinase K solution | 2.5g/ml Proteinase K in PBT | |||
| Digestion Stop Buffer | 2 mg/ml glycine in PBT | |||
| Pre-Hybridization Buffer | For 50 ml PHB: 12 ml DEPC treated water + 25 ml Formamide + 12.5 ml 20 x SSC + 50 ul Tween 20 + 500 ul 10 mg/ml salmon sperm (Rnase free, heat denatured prior to addition to solution). | |||
| Hybridization Buffer | Add 1 mg/ml glycogen to prehybridization buffer | |||
| Block Buffer | 50 mM Tris pH 6.8, 150 mM NaCl, 0.5% IGEPAL (NP40), 5 mg/ml BSA | |||
| Anti-DIG | Ab | Roche Applied Science | 11 093 274 910 | Alkaline Phosphatase conjugated |
| DIG Wash and Block Buffer Set | Roche Applied Science | 11 585 762 001 | ||
| Crystal Mount Aqueous Mounting Medium | Sigma | C0612 | Mounting Medium |
Referências
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