No Protocolo situ de asas da borboleta Pupal Usando Riboprobes
Summary
A fim de examinar a expressão gênica no tecido da asa pupal de Bicyclus anynana, apresentamos um protocolo otimizado para em hibridizações in situ usando riboprobes. Nós também fornecemos diretrizes para a otimização deste protocolo para o uso em asas pupal das espécies de Lepidoptera outros.
Abstract
Apresentamos aqui, em formato de vídeo, um protocolo para a hibridizações in situ nas asas pupal do Bicyclus borboleta anynana usando riboprobes. Em hibridizações in situ, um dos pilares da biologia do desenvolvimento, são úteis para estudar os padrões espaciais e temporais da expressão gênica no desenvolvimento de tecidos ao nível da transcrição. Se os anticorpos que alvejam os produtos de proteína de transcrição de genes ainda não foram desenvolvidos, e / ou existem múltiplas cópias do gene de uma proteína específica no genoma que não podem ser diferenciados utilizando anticorpos disponíveis, em situs pode ser usado em seu lugar. Enquanto um in situ para discos asa larval tem sido disponibilizados para a comunidade de borboletas por vários anos, o atual protocolo foi optimizado para as asas maiores e mais frágeis pupal.
Protocol
Discussion
Otimização dos protocolos existentes
Em hibridizações in situ em discos asa larval foram realizados com sucesso usando os discos de borboletas Precis coenia (Carroll et al, 1994;. Keys et al 1999;. Weatherbee et al 1999).. O protocolo atual foi adaptado de um protocolo detalhado disponíveis mediante solicitação por escrito do Laboratório Carroll para colorações asa larval. As mudanças que fizemos servem para acomodar as diferenças entre os tecidos asa de larva e pupa. Durante pupal dissecções asas posteriores, a membra…
Acknowledgements
Agradecemos a Jayne Selegue, Margaret Hollingsworth, Jin Berry, Ryo Futahashi, Najmus Sahar Mahfooz, Aleksandar Popadic, Bob Reed, Roche suporte técnico para ajudar na resolução deste protocolo. Agradecemos também a William Piel para aconselhamento sobre a edição do filme.
Materials
| Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Fix Buffer | 4% Paraformaldehyde in PBS | |||
| PBT | 0.1% Tween 20 in PBS | |||
| Proteinase K solution | 2.5g/ml Proteinase K in PBT | |||
| Digestion Stop Buffer | 2 mg/ml glycine in PBT | |||
| Pre-Hybridization Buffer | For 50 ml PHB: 12 ml DEPC treated water + 25 ml Formamide + 12.5 ml 20 x SSC + 50 ul Tween 20 + 500 ul 10 mg/ml salmon sperm (Rnase free, heat denatured prior to addition to solution). | |||
| Hybridization Buffer | Add 1 mg/ml glycogen to prehybridization buffer | |||
| Block Buffer | 50 mM Tris pH 6.8, 150 mM NaCl, 0.5% IGEPAL (NP40), 5 mg/ml BSA | |||
| Anti-DIG | Ab | Roche Applied Science | 11 093 274 910 | Alkaline Phosphatase conjugated |
| DIG Wash and Block Buffer Set | Roche Applied Science | 11 585 762 001 | ||
| Crystal Mount Aqueous Mounting Medium | Sigma | C0612 | Mounting Medium |
Referências
- Carroll, S. B., Gates, J., Keys, D. N., Paddock, S. W., Panganiban, G. E. F., Selegue, J. E., Williams, J. A. Pattern formation and eyespot determination in butterfly wings. Science. 265, 109-114 (1994).
- Chomczynski, P. Solubilization in formamide protects RNA from degradation. Nucleic Acids Research. 20, 3791-3792 (1992).
- Keys, D. N., Lewis, D. L., Selegue, J. E., Pearson, B. J., Goodrich, L. V., Johnson, R. J., Gates, J., Scott, M. P., Carroll, S. B. Recruitment of a hedgehog regulatory circuit in butterfly eyespot evolution. Science. 283, 532-534 (1999).
- Marcus, J. M., Ramos, D. M., Monteiro, A. Germ line transformation of the butterfly Bicyclus anynana. Proc R Soc Lond B (Suppl). 271, S263-S265 (2004).
- Monteiro, A., Glaser, G., Stockslagger, S., Glansdorp, N., Ramos, D. M. Comparative insights into questions of lepidopteran wing pattern homology. BMC Developmental Biology. 6, 52 (2006).
- Ramos, D. M., Kamal, F., Wimmer, E. A., Cartwright, A. N., Monteiro, A. Temporal and spatial control of transgene expresson using laser induction of the hsp70 promoter. BMC Developmental Biology. 6, 55 (2006).
- Weatherbee, S. D., Nijhout, H. F., Grunert, L. W., Halder, G., Galant, R., Selegue, J., Carroll, S. Ultrabithorax function in butterfly wings and the evolution of insect wing patterns. 9, 109-115 (1999).
